第一部分、中药PN-1对APP／PS1转基因阿尔茨海默病小鼠模型认知能力的改善及机制研究　　 背景：阿尔茨海默病（Alzheimersdisease，AD）是一种进行性发展的神经退行性疾病。该病发病年龄多在65岁以后，平均病程约8～10年，临床表现为记忆、认知、理解、判断推理能力以及社会适应能力、个人生活能力慢性进行性减退，最终发展为严重痴呆，常因褥疮、骨折、肺炎、营养不良等继发躯体疾病或衰竭而死亡。据预计，2050年在全球范围内每85人中将有1人罹患AD。随着全球人口老龄化程度的加剧，AD患者的日益增加已成为各国主要的保健和社会问题之一。AD的确切病因尚不清楚。但神经病理学研究结果提示该疾病与大脑内老年斑(senileplaque，SP)和神经原纤维缠结（neurofibrillarytangle，NFT）形成有关。可能的机制包括β淀粉样肽（amyloidbeta，Aβ）沉积、炎症损伤、氧化应激、自由基损伤等。其中，Aβ级联假说被认为是AD发病的中心环节。该假说认为Aβ聚集是始动因素，Aβ聚集后损伤突触，激活神经胶质细胞并诱发炎症反应，损伤突触传递和神经元功能，最终导致痴呆。目前，美国食品药物管理局(FDA)批准的5种治疗AD的药物仅限于乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂和NMDA受体拮抗剂，但均不能根治和逆转病程。因此，探索新的AD治疗策略和治疗药物对于降低AD死亡率和减轻社会负担均具有重要的意义。近年来，随着学习记忆的分子神经生物学机制研究的进展，神经元突触结构和功能对于维持正常的认知能力具有重要意义。并且，临床和动物模型研究均发现，AD脑内神经突触结构和功能存在缺陷。因此，本研究将从突触信号转导的角度探讨APP/PSI转基因小鼠模型学习记忆缺陷的分子生物学机制，并以改善突触功能为目的来评估和探讨中药治疗AD的疗效和机制。　　 方法：将5月龄的APP/PS1双转基因AD小鼠模型随机分为模型组(Vehicle)、安理申治疗组(Aricept,2mg/kg)、中药PN-1低(0.6g/kg)、中(1.2g/kg)、高(2.4g/kg)剂量组，并以同窝阴性的C57BL/6J小鼠作为正常对照组(WT)，每组20只，雌雄各半。给药组小鼠每天灌胃给药1次，同时模型组及正常组小鼠则给予等体积的双蒸水。给药前称量小鼠初始体重、摄食量和饮水量；给药期间，每两周逐只称量体重一次，同时称量并计算平均摄食量和饮水量。给药3个月后（8月龄）应用旷场实验、新物体识别实验和Morris水迷宫实验来观察PN-1对APP/PSI小鼠自主行为和认知功能的改善作用；免疫组织化学和硫磺素．S染色检测脑内老年斑含量；应用ELISA方法检测小鼠脑内可溶性和非可溶性Aβ40和Ap42总量；Westernblotting和免疫组织化学方法检测小鼠脑内可塑性相关蛋白的表达量；检测脑重、脑系数、血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(Cr)等指标的含量以评估PN-1对小鼠神经系统和肝肾功能的影响。　　 结果：PN-1给药3个月能够显著减少APP/PS1转基因小鼠在旷场中的活动量，增加新物体识别实验中的识别指数，减少Morris水迷宫定位航行实验中小鼠找到平台的潜伏期，并增加空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数和停留时间。PN-1给药4个月能够显著减少海马内可溶性Aβl-40和可溶性Aβl-42浓度；减少APP/PS1小鼠脑皮层和海马内老年斑的面积、数量和致密度。PN-1给药4个月能够增加APP/PS1小鼠脑内突触结合蛋白(Syt1)、钙调蛋白(CaM)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，增加磷酸化钙调激酶Ⅱ(p-caMⅡ，Thr286）、磷酸化钙调激酶Ⅳ(p-CaMKIV，Thr196+Thr200)和磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(p-CREB，Ser133)的相对含量。此外，PN-1给药3个月对APP/PS1小鼠体重、摄食量和饮水量均无显著影响；PN-1给药4个月对APP/PS1小鼠脑重、脑系数和肝肾功能亦无显著影响。　　 结论：PN-1显著减少APP/PS1转基因小鼠异常增高的兴奋性和异常增多的活动量、改善小鼠认知功能；减少脑内Aβ水平和淀粉样多肽沉积；增加脑内突触可塑性相关信号转导蛋白的表达水平。同时，该药未见对小鼠代谢、神经系统和肝肾功能有明显毒性作用。　　 第二部分、丙戊酸钠(VPA)对APP／PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠模型认知功能的作用及机制初探　　 背景：表观遗传学主要研究DNA序列未发生变化、可遗传的基因表达改变。近几年来，人们发现表观遗传修饰参与了大脑的学习和记忆过程。表观遗传作用通过DNA甲基化、组蛋白修饰等调控方式来实现对基因表达的控制。其中，由组蛋白去乙酰化酶(HDACs)介导的组蛋白修饰与学习和记忆的关系研究较为充分。HDACs是一个大的去乙酰化酶家族，其成员目前已知有18个不同的亚型，按蛋白同源性分为4大类：HDACI类（包括HDACI，2,3，8）、HDACⅡA类(包括HDAC4,5，7，9)、HDACⅡB类（包括HDAC6，10）、HDACⅢ类（包括SRIT1～7）和HDACⅣ类(HDAC11)。并且，研究发现，Ⅰ类中的HDAC2在海马神经突触结构和功能可塑性方面起着重要的负调控作用。因此，研究和开发HDAC抑制剂对于以认知障碍为主要表现的神经退行性疾病具有重要的治疗意义。　　 方法：5月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠随机分为模型组(Vehicle)、丙戊酸钠(VPA，100mg/kg)组，并以同窝阴性的C57BL/6J小鼠作为正常对照组(WT)，每组20只，雌雄各半。给药组小鼠每天腹腔注射给药1次，同时模型组及正常组小鼠给予等体积的生理盐水。给药3个月后（8月龄）应用旷场实验和Morris水迷宫实验观察VPA对APP/PS1小鼠自主行为和认知功能的改善作用；Westernblotting和免疫组化方法检测小鼠海马H3和H4表达量及其乙酰化水平、HDAC2、突触可塑性相关蛋白表达量；HDACs总活性检测试剂盒检测HDACs和HDAC2活性。　　 结果：VPA给药3个月后，APP/PSI转基因小鼠在旷场中的兴奋性和自主活动量较模型组小鼠显著减少，Morris水迷宫隐藏平台实验中小鼠找到平台的潜伏期显著缩短，并且空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数和滞留时间明显增加。VPA给药4个月后，小鼠海马组蛋白H3、H4表达量与模型组小鼠相比无显著变化，但乙酰化组蛋白H3(K9)、H4(K8)水平显著升高。此外，各组间HDAC2表达量并无显著性差异，但VPA给药后海马HDACs和HDAC2的活性显著降低、小鼠海马NR2B、CaM表达量较模型组显著增加，并且磷酸化CaMn(Tyr286)和磷酸化CREB(Ser133)水平也明显增加。　　 结论：1）VPA具有情绪稳定功能；2）VPA是一种HDACs抑制剂；3)VPA可能通过降低HDACs/HDAC2的活性、促进组蛋白乙酰化修饰、增加突触可塑性相关基因的表达水平来增强转基因小鼠的学习和记忆功能。　　 第三部分、成年C57BL／6J小鼠脑HDAC2的表达分布及细胞类型定位　　 背景：组蛋白乙酰化／去乙酰化修饰是染色质构象动态变化及转录调控的重要机制之一。在组蛋白乙酰基转移酶（HATs）的作用下，组蛋白H3或H4特定位点的赖氨酸残基发生乙酰化反应，使得染色质结构变得松散、转录因子更易于与基因启动子区相互结合并促进基因转录和表达。相反，乙酰化的组蛋白在组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的作用下发生脱乙酰化反应，诱导染色质固缩和基因表达减少。组蛋白乙酰化／去乙酰化修饰在神经细胞形成、学习和记忆、神经退行性疾病等生理和病理过程中的作用已有较多报道。并且，作为HDACs亚型之一的HDAC2在神经元发育分化、突触可塑性、抑郁、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)等生理和病理过程中起着重要的调控作用。但目前有关HDAC2在小鼠脑内的表达分布情况报道较少。　　 方法：应用免疫组化方法检测HDAC2在成年C57BL/6J小鼠脑内的表达分布情况；应用荧光双标技术检测HDAC2与神经元特异性标志物(MAP2)、胆碱能神经元特异性标志物(ChAT)、血清素能神经元特异性标志物(SERT)、儿茶酚胺能神经元特异性标志物(DBH)、谷氨酸能突触后神经元特异性标志物(NRI)、γ-氨基丁酸能突触后神经元特异性标志物(GABAARcα1)、少突胶质细胞标志物(MOSP)、星形胶质细胞标志物(GFAP)、小胶质细胞标志物(Iba-1)的共表达情况。　　 结果：免疫组化结果分析表明，HDAC2主要表达于细胞核内，并在成年C57BL/6J小鼠脑内分布较为广泛，尤以海马锥体细胞层、颗粒细胞层、小脑颗粒细胞层、嗅球内丛状层表达最为丰富；在丘脑和下丘脑的某些亚区呈轻、中度表达；在中脑、基底节和脑干的某些亚区表达较弱。荧光双标实验显示，HDAC2与MAP2存在明显的共定位现象。进一步的研究发现，ChAT、SERT、DBH、NR1、GABAARα1阳性染色的细胞内均有HDAC2的表达。在与胶质细胞标志物的共定位研究中发现，HDAC2与MOSP有明显的共表达现象，但在GFAP、Iba-1阳性染色的细胞内未见有HDAC2的表达。　　 结论：HDAC2在成年C57BL/6J小鼠脑内的分布较为广泛，主要表达于神经元、少突胶质细胞核内，但在星形胶质细胞和小胶质细胞内未见有HDAC2表达。