维生素B2介导的混菌体系促进多粘芽孢杆菌生成乙偶姻

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引入NADH/NAD+再生系统可以调节微生物发酵产物乙偶姻和2,3-丁二醇的比例分配。研究表明,共培养发酵可以利用其中某一菌株产生的过剩NADH形成NADH再生系统从而提高丁醇的产量。因此,合理的共培养体系可以促进微生物发酵产物乙偶姻的积累。本文通过外源添加维生素B2和共培养体系研究其对多粘芽孢杆菌CJX518的发酵产物乙偶姻和2,3-丁二醇的影响,从而探索有效的提高发酵产物乙偶姻产量的发酵方法,同时,通过研究乙偶姻的下游应用,进一步研究了利用前体物质乙偶姻微生物发酵生产四甲基吡嗪,解决乙偶姻分离纯化的难题。主要研究结果如下:1)外源添加维生素B2可以明显提高乙偶姻的产量和收率。实验表明,在0h添加5mg/L和10mg/L的维生素B2可以促进2,3-丁二醇向乙偶姻转化,在0,12,24h连续添加5mg/L的维生素B2也可促进乙偶姻产量,两者之间差别不明显,乙偶姻的产量提高122.2%,乙偶姻收率由0.16 g·g-1 glucose提高到0.40g·g-1glucose。外源添加的维生素B2可以影响发酵液中的溶氧和pH,并且通过胞内辅酶分析,维生素B2可以影响胞内的NADH/NAD+比值。通过酶活性分析显示,维生素B2可以提高多粘芽孢杆菌CJX518胞内的NADH脱氢酶和2,3-丁二醇脱氢酶活性,促进2,3-丁二醇向乙偶姻转化从而提高乙偶姻产量。2)多粘芽孢杆菌CJX518和能合成维生素B2的基因工程大肠杆菌LS02T共培养可以促进乙偶姻的产量。实验表明,先培养大肠杆菌LS02T 4h再以0.1:0.2(OD600)的接种比例接入多粘芽孢杆菌CJX518时乙偶姻产量提高74.2%。优化发酵条件(转速500rpm,通气量0.4vvm,pH 9.0)后,分批发酵时乙偶姻产量提高76.7%,且补料分批发酵乙偶姻的产量能达到57.24g/L,生产率为0.298g/(L.h),乙偶姻的收率为0.355 g.g-11 glucose。经分析显示,大肠杆菌产生的维生素B2或其他代谢物可以使多粘芽孢杆菌存活并提高2,3-丁二醇脱氢酶活性。3)根据发酵样品和四甲基吡嗪标品的出峰时间均在13.96min和分子量均为136.1,证明在多粘芽孢杆菌中也能通过微生物发酵产生四甲基吡嗪。实验结果表明,温度、无机铵盐种类和浓度都可影响四甲基吡嗪的产量,同时,多粘芽孢杆菌CJX518和大肠杆菌LS02T共培养体系比纯培养时四甲基吡嗪产量高。上述研究表明多粘芽孢杆菌和大肠杆菌共培养有很大的潜力,为提高乙偶姻生产能力以及促进其工业化应用提供了新思路。
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