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本文对MAL1启动子克隆与功能分析及α-amy基因表达载体构建与分泌表达进行了研究。主要成果如下:
1.克隆了MAL1启动子,以Zeocin抗性基因为报告基因构建了一系列质粒,证明了这一启动子在原核生物大肠杆菌中具有双向启动功能。
2.用含信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因作为报告基因,观察菌落在可溶性淀粉培养基上有无淀粉水解圈而直接筛选重组子,证明了MAL1启动子在真核生物酿酒酵母中5-3及3-5方向启动子均被葡萄糖抑制,均受蔗糖诱导。该思路避免了常用报告基因GPF基因和GUS基因,存在检测成本高且需昂贵仪器的弊端,代之以廉价的碘和淀粉,更经济也更直观,为α-淀粉酶基因作为新型报告基因奠定基础。
3.对酵母转化子摇瓶培养,确定了α-淀粉酶基因分泌表达的最佳培养条件。转化子YZAho为:培养16h时,菌体浓度OD600等于1.7时,α-淀粉酶酶活力为5.53U/100μl。