干细胞移植是治疗心肌梗死的一种非常有前景的新方法。在特定的微环境下骨髓间充质干细胞可分化为血管内皮细胞或者心肌细胞,并分泌血管生长因子,促进心肌血管生成,改善心脏功能。心肌微环境对于移植干细胞的存活、迁移、分化,以及能否有效发挥生物学效应起决定性作用。急性心肌梗死经干细胞移植治疗后,移植干细胞在梗死区会因为缺血/再灌注损伤、炎性因子等恶劣环境的作用而大量死亡,将极大的影响干细胞的疗效。因此,改善局部微环境使之更适合干细胞的存活及发挥效用,是目前重要的研究方向。超声对生物组织细胞有特定的生物学效应,这种生物学效应在加入微泡造影剂后变得更为明显。研究表明,超声辐照破坏微泡后,可使细胞膜通透性增加,微血管破裂,血管内皮间隙增宽,并可刺激内源性的血管生长因子分泌增加,促进血管新生。超声辐照微泡后产生的生物学效应可使组织微环境发生改变,超声破坏微泡可产生炎性反应,适度的炎性反应有助于干细胞的动员及归巢,但过度的炎性反应将导致干细胞凋亡及坏死,不利于干细胞的治疗。不同的超声辐照条件将产生不一致的生物学效应,在一定的条件下甚至导致心肌内出血及心肌细胞坏死。因此,超声辐照微泡的条件需要优化,使之促进血管生长因子及趋化因子表达,又不至于产生过度的炎性反应及心肌细胞坏死。基于上述理论及存在的问题,本研究拟观察不同强度脉冲超声辐照微泡后对梗死心肌组织细胞因子及粘附分子表达的影响,确定适宜干细胞移植治疗的超声辐照能量。并在超声辐照微泡改善心肌微环境后进行干细胞移植治疗,采用冠脉造影、超声心动图、SPECT等方法观察心肌灌注、冠脉侧枝循环形成及心脏射血分数改善情况,采用CD34免疫组织化学染色,观察心肌血管新生情况。共包括以下两个部分。第一部分:超声辐照微泡对心肌梗死犬心肌微环境的影响目的:探讨不同强度超声触发破坏微泡对犬心肌微环境的影响,确定用利于干细胞治疗的适宜超声辐照能量。方法:将20只通过开胸结扎冠状动脉左前降支的方法成功建立心肌梗死的动物随机分为4组,第1、2、3组犬在心肌梗死1周后通过静脉输入微泡,采用频率为1MHz,强度分别为1.5W/cm2、1.0W/cm2、0.5W/cm2的脉冲超声经胸壁辐照犬左室前壁,每次辐照10分钟,每2-3天辐照1次,累计辐照3次。第4组犬不采用超声辐照,作为对照组。第3次辐照后将犬处死,取左室前壁梗死周边区域心肌组织,通过HE染色,定量PCR、Western Blot及免疫组织化学法检测IL-1β、VCAM-1、SDF1、VEGF mRNA及蛋白质的表达水平。结果:定量PCR结果显示采用频率为1MHz,强度为1.5W/cm2的超声辐照组心肌组织表达VEGF、VCAM-1、SDF-1较对照组增加约5倍,IL-1β较对照组增加9倍;1.0W/cm2组表达VEGF、VCAM-1、SDF-1较对照组增加约3.8～4.7倍,IL-1β较对照组增加4.7倍;0.5W/cm2组表达VEGF、VCAM-1、SDF-1、IL-1β与对照组相比无统计学差异。Western Blot检测结果显示采用1.0W/cm2、1.5W/cm2超声辐照组犬心肌组织表达IL-1β、VCAM-1、SDF1、VEGF较0.5W/cm2组及对照组明显增加,1.5W/cm2组表达IL-1β较1.0W/cm2组明显增加。结论:频率为1MHz,强度为1.0W/cm2的超声靶向破坏微泡可促进血管生长因子及趋化因子的表达,而不引起严重的炎性反应,有利于干细胞的归巢及分化。第二部分:超声辐照微泡诱导心肌微环境改变联合骨髓间充质干细胞移植促进梗死心肌血管新生研究第一节犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定目的:探讨一种可靠、纯度高的犬骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)体外提取分离、纯化、培养和鉴定的方法。方法:采用骨髓穿刺获得骨髓干细胞,应用密度为1.073 g/ml的Percoll分离液,通过密度梯度离心法分离出犬骨髓单个核细胞,应用贴壁培养法获得纯度高的骨髓间充质干细胞,应用细胞免疫组织化学检测细胞表面标记蛋白CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和vWF的表达,应用流式细胞仪对犬BM-MSCs进行周期测定。结果:分离的犬干细胞CD29、CD44均呈阳性表达,CD31、CD34、CD45和vWF的表达为阴性;88.88%的细胞处在G0/G1期;由此证明所分离的细胞为犬BMMSCs,2周内经3代培养即可扩增到107细胞数量级,纯度可达到99%以上。结论:通过密度为1.073 g/ml的Percoll分离液筛选分离出的骨髓单个核细胞,经贴壁培养后可在短期内获得高纯度的骨髓间充质干细胞,可为治疗犬的心肌梗死提供充足的细胞来源。第二节超声靶向破坏微泡诱导心肌微环境改变联合骨髓间充质干细胞移植对梗死犬心肌血管新生的影响目的:探讨超声靶向破坏微泡改变诱导心肌微环境后对骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死疗效的影响。方法:将通过开胸结扎冠状动脉前降支的方法成功建立心肌梗死模型的15只犬,随机分A、B、C 3组,A组犬在梗死一周后,采用频率为1MHz,强度为1.0W/cm2的脉冲超声经胸壁辐照犬左室前壁,并同时静脉输入微泡,每2-3天辐照一次,辐照方法同前。B组及C组犬不采用超声辐照。在第3次辐照后10分钟后,通过介入方法,经冠状动脉注入自体来源骨髓间充质干细胞,B组犬也通过冠脉注入同等剂量自体骨髓间充质干细胞,C组犬行冠脉造影检查,注入同等体积的细胞培养液。A、B、C 3组犬均在冠脉造影前行超声及ECT检查评价心肌功能及心肌灌注情况。继续饲养1月后,对A、B、C 3组犬复查冠脉造影、超声心动图及ECT,并采用CD34免疫组织化学染色,观察心肌血管新生情况。结果:采用超声靶向破坏微泡联合干细胞移植组犬,在心肌组织灌注,冠脉侧枝循环及血管新生等方面均明显优于单纯干细胞移植组及对照组,超声靶向破坏微泡+干细胞移植组犬左室射血分数改善明显优于单纯干细胞移植组及对照组(69.8±4.62% vs 60.7±9.18% vs 52.5±3.73%,P<0.05)。结论:超声靶向破坏微泡诱导心肌微环境改变后可进一步增强骨髓间充质干细胞移植治疗的效果。可为心肌梗死及心力衰竭提供一种新型的干细胞移植治疗方法。