反胶束载体可以借助两亲性物质将亲水性药物增溶在脂相体系中。这一增溶技术不但避免了水分子给药物稳定性带来的各种不利影响,而且还可以提高改善药物的口服吸收。其简单的制备工艺、安全而又广阔的辅料组成和选择范围,不但在小分子药物方面具有广泛的适用性,而且在蛋白多肽药物传递方面也拥有较为广阔的应用前景。本论文以胰岛素为模型药物,对由胆盐辅料组成的反胶束载体处方和形成机制,胆盐作为胰岛素吸收促进剂的机制,以及相关制备工艺——叔丁醇/水共溶剂冻干和辅料对蛋白结构和生物学活性的影响进行了深入的探讨和研究。本文主要内容包括以下四个部分:1.叔丁醇/胆盐水溶液/磷脂三相体系预冻溶液相区的选择,相区理化性质研究,载体组成成分和油相及冻干保护剂的兼容性考察。相图绘制过程中发明了一种新的三相相图制备方法——两相组分交替滴定法。通过对两相体系的物理化学性质进行表征,我们对相图中增溶磷脂的机制进行了确证。结果表明,因叔丁醇在界面上的竞争性吸附,叔丁醇体积百分含量高于9.7%的情况下,胆盐不再显示界面活性,但仍然可以借助疏水相互作用形成胶束。当胆盐水溶液浓度高于28.0 mg/ml时,通过胶束增溶,假三相相图中近水溶液区域的澄明溶液相区面积明显扩大。当胆盐水溶液浓度达到70.0 mg/ml时,少量磷脂在叔丁醇不存在的情况下仍然可以实现均匀分散。兼容性考察结果表明,质量比例为3:7的各种磷脂/脱氧胆酸钠冻干产物可以溶于中链单甘油酯和二甘油酯中,但不溶于短链、中链和长链三甘油酯。这一问题可以通过适当的油相介质混合来解决。而含有冻干保护剂的处方无法均匀分散在多数油相体系中。2.胆盐作为胰岛素吸收促进剂机制的考察,胆盐对胰岛素聚集状态、结构和生物学活性的影响。胆盐可以有效地促进胰岛素的跨膜吸收,其主要原因之一就是胰岛素多聚体的解聚。本文明确揭示了胆盐存在条件下胰岛素在碱性缓冲溶液中的结构和分散状态变化,并详细确证了胆盐驱动的胰岛素解聚机制。具体的结果摘要如下:(1)胰岛素在pH10的缓冲溶液中以单体、二聚体、四聚体和六聚体的形式存在,单体和二聚体向多聚体转变的浓度范围为0.055-0.11 mg/ml;(2)高浓度胰岛素存在条件下,胆盐可以通过疏水相互作用绑缚到胰岛素单体、二聚体和四聚体表面上暴露的疏水位点,并在静电排斥的帮助下使胰岛素在水溶液中的动态平衡向胰岛素单体迁移;(3)当胆盐/胰岛素摩尔比例高于20:1时,胰岛素多聚体完全解聚成胰岛素单体,并与胆盐以及胆盐聚集体形成复合物。这些过程对胰岛素的结构均无显著影响。3.共溶剂体系对胰岛素聚集状态、结构和生物学活性的影响,以及共溶剂体系中胰岛素胆盐反胶束的形成机制研究。结果表明体积百分含量介于0-15%的叔丁醇对胰岛素聚集体也有解聚作用。这种解聚过程由于水分子的隔离作用,并未引起胰岛素结构发生任何显著变化。然而,当叔丁醇体积百分含量高于20.0%时,共溶剂体系不但可以使1.56 mg/ml的胰岛素完全解聚,而且还可以诱导蛋白发生以一系列结构变化:α螺旋含量由原来的59.3%升高到79.5%,同时无规卷曲和β折叠含量分别由原来的22.7%和12.8%降低到11.3%和3.7%,而β转角的含量基本维持不变。胆盐和叔丁醇共存条件下,胰岛素在溶液中的结构稳定性降低。在此基础上根据蛋白生物学活性考察,我们进一步缩小了制备胰岛素反胶束所用的预冻溶液相区——共溶剂体系叔丁醇体积百分比例不应高于10%。最后,我们清晰的证明了共溶剂体系中胰岛素反胶束载体形成的源头性机制——低浓度叔丁醇存在的共溶剂体系中胆盐/胰岛素摩尔比例为98:1时,胆盐和单体胰岛素通过疏水相互作用自组装并形成胆盐/胰岛素单体复合物。该复合物的形成并未改变胰岛素的固有活性结构。4.反胶束载体制备工艺——叔丁醇/水共溶剂冻干及辅料对胰岛素结构和生物学活性的影响。结果表明,冷冻干燥过程中影响蛋白结构的因素主要包括冻结浓缩、界面失活和干燥脱水,而蛋白结构的变化程度主要受共溶剂组成的影响。溶剂组成接近低共融混和物(叔丁醇体积百分含量为25%)的体系由于冻结过程中形成较多界面从而对蛋白结构的破坏程度最大。该体系条件下冻干胰岛素的糖尿病小鼠降血糖效果峰值出现最早,约为0.5小时。然而,胆盐/胰岛素摩尔比例为50:1和100:1条件下,胆盐可以通过减少蛋白界面失活来有效保护蛋白的结构和生物学活性。该条件下,所有处方对糖尿病小鼠降血糖作用持续至少2小时,降血糖效果峰值出现时间大于或等于1小时。此外,辅料(如胆盐和海藻糖)也可以通过物理稀释作用有效避免冻结浓缩过程中蛋白分子间β折叠结构的形成。蛋白冷冻干燥再水化后的研究结果表明,没有任何辅料存在条件下,预冻溶液叔丁醇体积百分含量为50%的处方蛋白结构不具可逆性。而预冻溶液叔丁醇体积百分含量低于50%的处方和其他含有辅料的处方蛋白结构均为完全可逆。后续的生物学活性实验结果表明,蛋白表观二级结构含量完全可逆的处方仍然具有不同的降血糖生物学活性,但与处方工艺过程中的蛋白结构变化幅度一致:蛋白结构变化幅度越大,生物学活性越低,反之亦然。推测其原因是水化过程中蛋白活性中心的二级或三级结构在重组过程中并未完全恢复或存在一定错误。因此,蛋白制剂过程中,尽量避免蛋白结构发生变化或尽量减小结构变化程度对于保护蛋白的生物学活性尤为重要。上述发现和机制研究对蛋白多肽药物传递和醇/水共溶剂蛋白冻干制剂制备具有重要的指导和借鉴意义。