生物固氮是维持生态平衡和人类生存的不可缺少的环节,对于增加粮食产量、合理使用氮肥降低生产成本、防止土壤盐碱化和水体富营养化、节约能源等方面都具有极其重要的意义。本研究通过乙炔还原法、全氮比色法和编码固氮酶的nifH基因片段扩增三种方法对实验室分离的土壤农杆菌Ag39(Agrobacterium tumefaciens 39)进行固氮活性测定,发现该菌株的nifH基因片段(约1000 bp)比其它固氮菌的nifH基因片段(约360 bp)大,经测序后GenBank上比对该基因,未找到其同源基因,推测该基因可能是一未知基因。为验证土壤农杆菌Ag39中的这一未知基因是否为新基因,本文采用染色体步移中的反向PCR方法克隆该基因,利用载体pET32a(+)在大肠杆菌BL21中异源表达该基因,并对基因编码蛋白的性质进行了分析。经过多种测定方法,尤其是15N2同位素示踪法,证明该基因诱导表达后无论是在细胞内还是离体酶液,该基因都能够进行固氮。具体研究结果如下:　　 1、高效固氮菌株的筛选　　 采用DN无氮培养基,结合乙炔还原法、全氮比色法和PCR扩增固氮酶nifH基因片段三种方法从实验室分离的代表性固氮菌中筛选高固氮活性菌株,其中乙炔还原法和全氮比色法测得32个供试菌株均可固氮。阴沟肠杆菌En3208(Enterobacter cloacae 3208)的固氮活性很高,部分菌株固氮能力比较弱。其中31个供试菌株用2种方法测定固氮能力一致,而两种方法测定土壤农杆菌Ag39固氮能力存在显著差异,其固氮活性与生成的乙烯量不呈正相关,且该菌株的nifH基因片段(约1000 bp)比其它固氮菌的nifH基因片段(约360 bp)大,对氨的敏感性低于阴沟肠杆菌En3208。RT-PCR的研究结果进一步表明土壤农杆菌Ag39中含有新的nifH基因片段,而且对氨的敏感性不强,说明土壤农杆菌Ag39不同于传统的固氮菌,可能代表一种新的固氮机理。　　 2、土壤农杆菌Ag39中新基因的克隆　　 TA克隆土壤农杆菌Ag39中的nifH(1000 bp)片段,测序经GenBank Blast发现该基因为一新的未知基因。即使在已经完成的土壤农杆菌基因组全序列中,也没有找到其同源序列。以其为模板设计一对反向引物,采用染色体步移中的反向PCR方法扩增得到长度分别为450 bp和900 bp的两个片段,经序列拼接,得到2313 bp的预测全长序列,根据推测的拼接结果设计引物,最终扩增出1800 bp大小的全长基因片段。此基因包含一个大小为585 bp的开放阅读框,编码194个氨基酸。利用NCBI上BLAST软件分析,此基因的核苷酸序列与组氨酸蛋白激酶的部分相似系数为74％,编码的氨基酸序列与组氨酸蛋白激酶的部分相似系数为63％,因此初步推断该基因是一新基因,命名为nifT44基因。　　 3、土壤农杆菌Ag39中nifT44基因的原核表达及其纯化　　 设计一对加酶切位点的引物,扩增此开放阅读框,用表达载体pET32a(+)携带nifT44基因转化宿主菌BL21;用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳检测nifT44基因成功表达。并对其诱导条件进行了优化,当OD600达到0.4左右,1∶100接菌,25℃,0.4 mmol/L IPTG诱导5小时后表达的可溶性蛋白量最大。扩大诱导后,采用沉淀、透析、过滤、层析相结合的方法纯化此可溶性蛋白,凝血酶酶切16小时后经SDS-PAGE检测目的蛋白约为23 KD,与nifT44基因推导的蛋白质的理论分子量完全符合。　　 4、土壤农杆菌Ag39中nifT44基因诱导表达后固氮能力测定　　 采用乙炔还原法、流动注射分析仪和15N2同位素示踪法三种方法分别对nifT44基因表达后细胞内和离体酶液的固氮能力作了研究。结果表明:无论是在细胞内还是离体酶液,三种方法都证明nifT44基因诱导表达后能够固氮。乙炔还原法和流动注射分析仪测定nifT44基因表达后离体酶液固氮能力时与对照相比均达到了显著水平,15N2同位素示踪法测定时15N2丰度达到了0.605 atom％,比天然丰度提高约0.245atom％,足以证明nifT44基因诱导表达后发生了固氮反应,是一种固氮酶基因。　　 5、土壤农杆菌Ag39固氮酶固氮特性研究　　 通过流动注射分析仪对土壤农杆菌Ag39固氮酶的固氮特性做了初步研究,发现固氮酶反应48小时后固氮活性最高,20℃.55℃,pH 4.5-pH 9之间都能发生固氮反应,35℃时固氮活性最高;固氮酶对NH4+和NaCI的耐受性很强,当NH4+浓度达到20 mmol/L,NaCl含量达到5％时仍有较低的固氮活性。大多数金属离子如K+、Zn2+、Ni+、V5+和Cu2+对固氮酶的酶活均有不同程度的抑制作用,化学抑制剂EDTA、SDS和PMSF对酶反应的抑制作用比较明显,DMSO可以完全抑制该固氮酶的酶活。新固氮酶对氧气不敏感,有氧条件下,注入N2和H2可以提高生成的NH4+含量,加入CO2对酶活影响不大。生理生化试验结果显示,土壤农杆菌新基因诱导表达后可利用的碳源为D-乳糖、木糖、水杨酸钠和赖氨酸,且在pH3的强酸性条件不能发生固氮反应。　　 6、土壤农杆菌Ag39固氮酶产气性能研究　　 研究发现土壤农杆菌Ag39固氮酶置于空气中短时密封培养后能产生少量的甲烷、乙烯和乙炔气体。进一步的研究发现土壤农杆菌固氮酶产气需要光照和氧气,在空气中注入微量臭氧该酶的产气量明显提高,与注入其它气体相比差异显著,说明臭氧和空气中某种成份对固氮酶产气有促进作用。由此初步推断固氮酶可利用臭氧氧化产生能量将氮气的三键打开,生成NH3,同时二氧化碳与氢气反应生成甲烷、乙烯和乙炔。　　 7、阴沟肠杆菌En3208中nifT44基因的原核表达及其特性研究　　 采用已建立的PCR扩增技术,克隆方法和pET原核表达体系,从高效固氮的阴沟肠杆菌En3208也克隆到nifT44基因。用表达载体pET32a(+)携带该基因转化宿主菌BL21;用IPTG诱导表达可溶性蛋白,组氨酸标签纯化柱纯化目的蛋白。采用乙炔还原法、流动注射分析仪和15N2同位素示踪法三种方法分别对阴沟肠杆菌En3208中nifT44基因诱导后细胞内和离体酶液的固氮能力及特性作了研究,研究结果与Ag39中的nifT44基因具有很好的一致性。　　 本试验从农杆菌中Ag39中克隆鉴定出的nifT44基因对氧气不敏感,易于实验操作,这将是生物固氮研究中的一大突破,为以后生物固氮研究提供了新的思路和经验,使生物固氮研究朝着实际应用的方向进一步迈进。