背景:抗蛇毒抗体根据来源可分为抗蛇毒血清(antivenene,AV)及抗蛇毒鸡卵黄抗体(immunoglobulins in yolk, IgY)两种,前者从哺乳动物的血液中分离而得,后者系从禽类的卵黄中提取。自20世纪90年代以来,国外学者已从鸡卵黄中制备出了抗cobra、Russell’s viper、Saw-scaled viper,B. arietans, B. nasicornis, B. rhinoceros, N. melanoleuca和N. mossambica等数种IgY,并能有效中和相应蛇毒[1,2,3]。在国内,抗眼镜王蛇[4]、抗蝮蛇[5]、抗眼镜蛇[6,7]和抗蝰蛇毒IgY[8]的制备及其特性研究亦有报道。与从其他哺乳动物(如鼠、兔、猪、马、牛等)血液中获得抗体相比,卵黄抗体具有无法比拟的优越性[9,10](Schade et al.1992; Larsson et al.,1991):不与蛋白G或蛋白A结合,不会激活补体系统,不与类风湿因子结合,避免了免疫检测中的假阴性和假阳性问题;鸡蛋来源方便,生产成本低,适于大规模生产;由免疫母鸡所生的鸡蛋黄中只有一种抗体,均一性好,理化性质稳定,耐酸,耐热,易于保存,运输和使用均很方便。另外鸡与哺乳动物种系关系远,少量刺激时即容易产生强免疫反应。研制一种针对华南地区多种剧毒蛇的通用蛇伤防、治特效制剂—多价AV,可在无需明确蛇伤的毒蛇种类情况下立即使用,以赢得有效的最佳治疗时机,对避免严重病变的发生和降低死亡率有着重要作用。在本实验室先前制备有单价抗眼镜蛇及抗蝰蛇毒IgY,本实验拟进一步研制双价抗蛇毒鸡卵黄抗体,为蛇伤救助提供新的途径。目的:通过制备双价抗眼镜蛇、蝰蛇毒鸡卵黄抗体,检测其生物活性,并观察其以口服制剂的形式对眼镜蛇、蝰蛇伤小鼠的保护作用,为蛇伤的预防和治疗提供一种新的方法,为替代马源性抗蛇毒血清奠定基础。方法:一、双价抗蛇毒IgY的制备与提取1、双价抗蛇毒IgY的制备制订合适的免疫方案,利用本所专利——蛇毒取毒器制备抗原眼镜蛇、蝰蛇毒,分别与福氏佐剂按1:1(V/V)置自制的乳化器充分乳化,初次免疫采用福氏完全佐剂乳化蛇毒,以后均用福氏不完全佐剂乳化蛇毒。每种抗原在初次免疫后的第三周、第五周各进行1次加强免疫,免疫剂量间歇、逐渐加量。两种单一抗原按顺序依次交替注入单只鸡体内(双翼、胸、腹部和背部皮下及肌肉多位点注射),注入间隔周期为一周。2、双价抗蛇毒IgY的检测双向免疫扩散和免疫电泳鉴定卵黄中的特异性抗体;SDS-PAGE测定抗体产物的纯度;以间接ELISA法检测特异性IgY抗体效价的动态变化以及IgY在血浆内的效价变化。3、双价抗蛇毒IgY的提取采用本实验过程中发明的卵黄分离收集器从卵清中分离出卵黄,用水稀释法提取IgY抗体。二、双价抗蛇毒IgY的生物特性研究1、利用双向免疫扩散法测定抗蛇毒IgY与中国常见10种蛇毒的交叉免疫反应及其反应强度。2、眼镜蛇、蝰蛇毒对卵黄膜均有不同程度的溶膜作用,用自制的卵黄膜溶膜检测仪观察双价抗蛇毒IgY对蛇毒溶膜活性的中和作用。3、双价抗蛇毒IgY分别与眼镜蛇、蝰蛇毒在体外中和,腹腔注射小鼠,观察双价抗蛇毒IgY对蛇毒致死活性的中和作用。三、双价抗蛇毒IgY的相关动物实验1、双价抗蛇毒IgY按高、中、低三个浓度灌胃小鼠,在不同时间点杀鼠取血分离血浆,用间接ELISA法检测灌胃小鼠血浆中双价抗蛇毒IgY的效价。2、双价抗蛇毒IgY按高、中、低三个浓度灌胃小鼠,在不同时间点分别为小鼠腹腔注射眼镜蛇、蝰蛇毒,检测口服制剂双价抗蛇毒IgY对小鼠的保护作用。四、统计采用t检验,SPSS软件等统计分析实验数据。结果:1、利用蛇毒取毒器制备的蛇毒活性高,含杂质量少。用眼镜蛇、蝰蛇毒粗毒、初次小剂量免疫后,卵黄中第9天即可检测到特异性卵黄抗体。经间歇、逐渐加量加强免疫,抗体效价持续增高,达到较高水平后,能在较长时间内一直维持高效价。2、在实验过程中制备了卵黄分离收集器(专利号:2006200559807.3),利用此仪器收集试验用卵黄,卵清、卵黄分离度高,卵黄膜光洁、完整,卵清残留量少,有利于进一步的分离纯化。3、水稀释法去脂效果好,若进一步经硫酸铵盐析后,蛋白回收率约为40%。如能进一步优化条件,经嗜硫色谱、疏水色谱及凝胶层析等方法纯化抗体,有望得到纯度更高的抗体。4、经双向免疫扩散法测定,所制双价抗蛇毒IgY与舟山眼镜蛇、眼镜王蛇反应最明显,反应沉淀线最清晰,与眼镜蛇亚科和蝰蛇亚科的部分蛇毒有强弱不等的交叉反应;与蝮蛇亚科的蝮蛇、尖吻蝮等部分蛇毒无明显交叉反应。5、根据卵黄膜溶膜检测仪的时间结果证明,一定量的水提物抗蛇毒IgY完全能对抗眼镜蛇、蝰蛇毒对卵黄膜的溶膜作用。6、体外中和实验表明,一定浓度的水提物抗蛇毒IgY可以完全保护实验小鼠免受2倍LD50眼镜蛇、蝰蛇毒的攻击。7、不同浓度剂量的抗蛇毒IgY能对眼镜蛇、蝰蛇伤小鼠有不同程度的保护作用;当IgY剂量足够高时,能够完全保护小鼠免受眼镜蛇、蝰蛇毒的攻击。结论:1、以眼镜蛇、蝰蛇毒粗毒免疫莱杭母鸡,经初次小剂量、间歇、逐渐加量加强免疫,可持续数周获得含有高效价、特异性抗体的鸡卵黄抗体。2、自制的卵黄分离收集器可批量分离卵黄,卵黄膜溶膜检测仪可以精确地检测蛇毒或其他毒素的溶膜活性,在工业化生产IgY方面有较好的应用前景。3、经水稀释法提取分离抗体,纯度可达电泳纯,抗体活性强,回收率高、活性好,方法经济、简单易行。4、口服制剂的抗蛇毒IgY,若能增加其免疫抗原的种类,抗体纯化程度更高、效价更高,则其保护作用和应用范围将得以极大扩展。