癌症是严重危害公众健康的疾病之一,其发病率和死亡率一直在攀升,已成为疾病死因之首。近年来众多科研成果显示:恶性肿瘤的很多临床特征,比如:分期、复发转移和预后等,与很多基因及其相关蛋白之间存在密切联系。同时,在恶性肿瘤的发生、发展过程中,这些相关的基因和蛋白表达可能扮演着重要角色,在不久的将来可能会作为抗肿瘤治疗的新的基因位点或蛋白分子靶点。故而,更加深入的钻研恶性肿瘤细胞的生物学特性及其具体的分子机制,尽早发现新的更有价值的肿瘤标记物,对预防肿瘤的发生、早期肿瘤的诊断、预测肿瘤的预后、指导肿瘤的治疗提供更有效的方法,对肿瘤患者的综合治疗有着极其重要的临床价值。卵巢癌(Ovarian cancer,OV)、宫颈癌、子宫内膜癌是女性患者中最常见的三大生殖系统恶性肿瘤性疾病,其中卵巢癌的发病率稍低于宫颈癌和子宫内膜癌,但其死亡率却是所有女性生殖系统恶性肿瘤首位。在美国,有数据统计显示:仅2012年一年,有新发卵巢癌患者22240例,而预计一半以上(约14030)的患者将在1年内死亡。卵巢癌的具体发病机制目前尚未完全明确。发病初期,卵巢癌患者在疾病早期一般并不表现出特异的临床症状,同时卵巢癌患者起病隐匿,出现肿瘤相关症状而就诊的大多是晚期的肿瘤患者,已经出现肿瘤细胞的局部播散和远处的转移。近年来,由于手术技术的提高以及新化疗药物和方案的应用,卵巢癌患者5年生存率已有明显改善,可达为42.9%,但是由于肿瘤的高复发率(大于80%),使得晚期复发性卵巢癌患者长期预后很差。目前,国内外卵巢癌的主要临床治疗方案包括以卵巢肿瘤细胞减灭术为基础,术后联合新辅助化疗的治疗方案,缓解率很高,约70%-80%。但是化疗药物具有严重的药物副反应,并且化疗药物的主要成分以细胞毒药物为主,其产生的一系列副作用大大的限制了化疗药物在临床应用的疗程和剂量,使得体内内残存的卵巢癌肿瘤细胞很难被化疗药物完全的、彻底的清除,造成临床治疗失败和肿瘤复发转移,从而预后不良。目前,随着卫生科学技术的发展,随着医学科技的进步,临床卵巢癌的诊治水平有很大提高,但是由于卵巢癌起病隐匿,患者并没有特异的临床症状,早期诊断困难,大多数就诊时已经是癌症晚期,出现了肿瘤细胞的局部播散,盆腹腔脏器的种植和转移,甚至远处脏器组织的侵犯。因此虽然卵巢癌短期的生存率有了明显改善,但是其远期复发率高,预后仍然很差。改善卵巢癌患者的预后,需要我们对卵巢癌细胞发生、转移及侵袭等分子机制等进行进一步深入研究。因此,卵巢癌的早期诊断、早期治疗,以及对于其转移复发的早期诊治,是我们亟待解决的临床问题。基于上述临床工作中目前存在的卵巢癌治疗的挑战和难点,找寻新的能够抑制卵巢肿瘤细胞增殖、迁移的方法,对于卵巢癌临床治疗意义非凡,基因治疗是我们目前能够找到的可能达到这一目的的新的治疗方法。越来越多的研究开始探讨卵巢癌的发生机制、细胞和分子机制,期望能够找到新的卵巢癌治疗途径。卵巢癌的病理生理学过程复杂,近年来,基因和蛋白水平和具体分子机制的研究被广泛开展,发现很多基因位点和相关蛋白分子,可能与卵巢癌的临床特征、复发和转移等生物学特征和行为有关。而且卵巢癌发生发展步骤中的任一环节都有可能成为我们医学中可用的分子靶点,所以,研究卵巢癌增殖和转移的分子机制,准确的预测患者预后、阻止肿瘤细胞的转移侵袭,是提高临床对卵巢癌诊治的疗效、改善卵巢癌患者预后的突破口,同时从分子水平诊断卵巢癌的转移,选择新型的、有效的、副作用小的治疗方案进行干预和治疗都有着重要的意义。钙粘蛋白(protocadherins,PCDHs)又被称为钙离子依赖性黏附蛋白,是具有110个氨基酸残基的细胞外钙粘蛋白重复子,属于细胞黏附分子家族的一员。PCDHs家族根据其基因组结构,可分为2个大群:非聚集性PCDHs和聚集性PCDHs。在生命个体发育到成年阶段的过程中,钙粘蛋白在生命体的形态学方面发挥了重要作用。最近几年以来,PCDHs在肿瘤发生发展中的作用和机制的研究被广泛开展、并且深入探究。有研究证实在人结直肠癌细胞株中,PCDH10基因处于低表达水平,而具体的分子机制可能是由于PCDH10启动子甲基化造成的。人结直肠癌细胞株中应用去甲基化药物5-Aza处理后,发现PCDH10基因表达水平升高,同时结肠癌细胞增殖及迁移能力下降,因此,该学者指出PCDH10基因在结直肠癌中起到了抑癌基因的作用。此外,也有部分学者的研究表明PCDH17基因在结肠癌中也起到了抑癌基因的作用,PCDH17基因表达水平升高后,结肠癌细胞的增殖能力下降、凋亡增加、自噬作用可能被诱发。其他PCDHs基因,诸如PCDH8、9、10、20在其他系统和器官的恶性肿瘤中作用也被广泛研究,诸如胃癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、乳腺癌、急性白血病等等,多数在恶性肿瘤发生发展中起到抑癌基因的作用。PCDH8蛋白是钙黏蛋白超家族的成员之一,它通过编码一种整合膜蛋白介导细胞粘附功能。在分子结构上,PCDH8和典型钙粘蛋白不同,典型钙粘蛋白一般由15-17个外显子编码组成,而PCDH8编码基因仅仅只有3个外显子组成。其中值得特别注意的是,PCDH8基因有一个较大型的胞外结构域,是由第一外显子编码,由6个蛋白结构域以及1个跨膜区域组成。目前,大量的研究已经证实PCDH8基因在乳腺癌、胃癌、结直肠癌和鼻咽癌等多种恶性肿瘤中的表达明显下降,结果具有统计学意义,同时,这些表达异常可能与PCDH8基因启动子甲基化有关。大量的研究已经证实PCDH8在多种人类恶性肿瘤的进展中发挥了重要的作用,在肿瘤组织和肿瘤细胞株中表达异常下调或缺失,可能是新型的、潜在的抑癌基因,并且被证实PCDH8表达异常很可能是由于其启动子甲基化所致。结合临床资料分析发现,PCDH8的甲基化水平和肿瘤的恶性程度、生存预后密切相关。以上这些研究表明,PCDH8有可能成为恶性肿瘤早期诊断预警和预后判断的一个新型分子标志物。并且应用去甲基化药物5-Aza处理后,PCDH8基因的表达水平在肿瘤细胞中可能恢复正常,因此,去甲基化药物在不久的将来可能被广泛应用在恶性肿瘤的临床治疗中。最近几年以来,对于PCDH8基因的相关研究有了很大突破,然而PCDH8基因对于恶性肿瘤的发生、发展、转移等的具体分子机制,和下游的信号通路并不十分清楚,将其应用到临床恶性肿瘤的早诊早治中去还有很长路要走。基于上述研究的结果和现状,PCDH8基因可能是新型的、潜在的抑癌基因,然而PCDH8基因在卵巢癌中的表达情况以及发病中的功能和机制尚无深入研究。所以本实验的目的是研究PCDH8基因在卵巢癌中的表达水平及临床意义,并对进一步的机制研究进行初步的探索。本实验首先应用免疫组织化学方法及组织芯片技术检测PCDH8蛋白在卵巢癌组织中的表达情况,发现PCDH8蛋白的表达强度与患者临床特征及预后之间存在紧密的联系,随后我们在体内外实验中证实PCDH8在卵巢癌中的作用,并且拟从临床肿瘤组织标本、体外细胞系和体内移植瘤模型三个层面系统、全面的研究PCDH8在卵巢癌中发生发展的功能和调控机制,为PCDH8作为卵巢癌精准治疗靶点提供了一定的理论基础。第一部分PCDH8在卵巢癌中的表达及其和临床预后的关系目的:研究PCDH8蛋白在卵巢癌组织中的表达及其和临床特征与预后的关系,初步探索PCDH8在卵巢癌疾病进展中的作用。方法:1.应用Western Blot方法检测PCDH8蛋白在8对卵巢癌及对应癌旁组织中的表达情况,分析PCDH8在卵巢癌和正常组织的表达差异;2.应用免疫组织化学方法及组织芯片技术检测PCDH8蛋白在卵巢癌组织中的表达情况,并且分析PCDH8蛋白表达强度与患者临床特征及生存预后之间的关系。3.数据应用SPSS 23.0(SPSS软件,美国IBM公司)进行统计分析。研究结果以均数±标准差表示,数值类变量比较采用配对或非配对t检验。临床病理特征单因素分析采用卡方检验,将单因素中有统计学差异(P<0.05)的变量带入多因素COX回归分析模型进行多因素分析。生存分析应用Kaplan-Meier法检测并应用graphpad prism6.0绘制生存曲线,以上所有检验定义P<0.05认为有统计学意义。结果:1.Western Blot方法检测结果提示卵巢癌组织中的表达与癌旁对比,卵巢癌组织中PCDH8表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。2.PCDH8表达水平与卵巢癌临床病理参数的单因素和多因素COX回归分析结果提示:PCDH8表达水平与卵巢癌患者预后(P=0.029)、转移(P=0.048)、FIGO分期(P=0.0065)、和复发(P=0.0011)明显相关,而与年龄、CA-125表达无明显相关;PCDH8的低表达提示卵巢癌预后不良(P﹤0.01),并且是影响卵巢癌患者总体生存的独立风险因素。3.Kaplan-Meier生存分析结果显示PCDH8低表达的卵巢癌患者的生存时间明显差于PCDH8高表达的患者(P﹤0.05),提示PCDH8的表达和卵巢癌患者的临床预后密切相关。结论:卵巢患者组织中PCDH8的表达水平和患者临床恶性表型和生存预后密切相关,PCDH8可能参与了卵巢癌的疾病进程。第二部分PCDH8基因对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其分子机制目的:探讨PCDH8在卵巢癌增殖、侵袭和转移中的调节作用及其分子机制,旨在从新的角度阐明卵巢癌发生发展的机制,为寻找新的卵巢癌治疗靶点提供理论依据。方法:1.利用慢病毒技术在卵巢癌细胞中过表达PCDH8基因;2.分别利用RT-PCR、Westernblot检测PCDH8基因在卵巢癌中的过表达效率;3.采用划痕修复实验(Wound Healing assay),检测PCDH8基因过表达后卵巢癌细胞的迁移能力变化情况。4.采用细胞侵袭实验(Transwell assay),检测PCDH8基因过表达后卵巢癌细胞侵袭能力的变化情况。5.采用克隆形成实验(Colony Formation)分析检测PCDH8基因过表达后卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。6.应用基因芯片技术研究在卵巢癌细胞中PCDH8基因过表达后,细胞转录组m RNA基因表达谱变化情况,同时利用生物信息学进行GO分析、KEGG通路分析。7.数据应用SPSS 23.0(SPSS软件,美国IBM公司)进行统计分析。研究结果以均数±标准差表示,数值类变量比较采用配对或非配对t检验。以上所有检验定义P<0.05认为有统计学意义。结果:1.经RT-PCR、Westernblot和免疫荧光技术检测验证,转染PCDH8慢病毒的卵巢癌细胞中PCDH8基因表达水平显著增高,提示PCDH8过表达的卵巢癌细胞构建成功;2.增殖实验结果提示:与对照组的卵巢癌细胞相比,PCDH8过表达的卵巢癌细胞的卵巢癌细胞的生长被显著抑制,差异具有统计学意义(P<0.05);3.细胞迁移实验结果提示:经过48h迁移后,与对照组的卵巢癌细胞相比,PCDH8过表达的卵巢癌细胞的划痕迁移距离显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.细胞侵袭实验结果提示:与对照组的卵巢癌细胞相比,PCDH8过表达的卵巢癌细胞侵袭入下层小室的细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.克隆形成实验结果提示:与对照组的卵巢癌细胞相比,PCDH8过表达的卵巢癌细胞的克隆形成的数目明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.基因芯片分析结果发现差异表达基因有112个(Fold chang≥2,P<0.05),其中基因表达增高,呈现上调趋势者有48个,而基因表达降低,呈下调趋势者有64个。7.对这些差异表达基因进行生物信息学分析。差异基因的GO分析,差异表达基因主要集中在对细胞凋亡、上皮发育、多细胞生物大分子代谢等过程中。结论:PCDH8过表达后显著抑制了卵巢癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力和克隆形成能力,提示PCDH8在卵巢癌的发展中可能起到抑癌基因的作用。第三部分PCDH8对卵巢癌细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的:通过构建PCDH8稳定过表达的卵巢癌细胞系,并皮下注射入裸鼠体内成瘤,观察体内PCDH8对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法:1.将PCDH8稳定过表达组(Lenti-PCDH8)和空病毒对照组(Lenti-mock)的卵巢癌细胞注入裸鼠皮下,构建卵巢癌移植瘤模型,在体内观察PCDH8过表达对卵巢癌生物学行为的影响。2.观察PCDH8稳定过表达组(Lenti-PCDH8)和空病毒对照组(Lenti-mock)裸鼠肿瘤体积和重量的变化,应用活体成像技术检测移植瘤荧光强度的变化,绘制生长曲线。3.免疫组织化学技术检测裸鼠肿瘤组织的PCDH8的表达。4.数据应用SPSS 23.0(SPSS软件,美国IBM公司)进行统计分析。研究结果以均数±标准差表示,数值类变量比较采用配对或非配对t检验,以上所有检验定义P<0.05认为有统计学意义。结果:1.裸鼠体内实验结果显示,转染过表达PCDH8的裸鼠组比转染空病毒组,肿瘤体积和重量减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.裸鼠体内实验结果显示,转染过表达PCDH8的裸鼠组比转染空病毒组,移植瘤荧光强度显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.裸鼠体内实验结果显示,转染过表达PCDH8的裸鼠组比转染空病毒组,肿瘤细胞增殖速度降低(P<0.05)。结论:PCDH8过表达抑制卵巢癌裸鼠移植瘤模型的体内的增殖速度,进一步确认了体外实验的结果,证实了PCDH8在卵巢癌的发展中可能起到抑癌基因的作用的功能。全文结论:1.PCDH8在卵巢癌中表达明显降低。PCDH8的异常低表达和患者转移、复发等临床恶性表型密切相关,同时PCDH8高表达患者的生存时间明显长于PCDH8低表达的患者,提示PCDH8在卵巢癌的疾病进展中可能起到抑癌基因的作用,可成为恶性临床表型预测和判断预后的潜在靶点。2.体外研究结果显示:PCDH8过表达后,卵巢癌的增殖能力、迁移能力、侵袭能力以及克隆形成能力明显下降;在体内研究中,PCDH8过表达对卵巢癌成瘤能力的抑制被进一步验证。3.本研究先后通过体外细胞株实验以及裸鼠体内荷瘤实验,发现卵巢癌组织中PCDH8基因的低表达,并初步其探究了在卵巢癌侵袭转移中PCDH8基因的具体作用和可能的机制,为PCDH8作为卵巢癌精准治疗靶点提供了一定的理论基础。