桃〔Prunuspersica (L.) Batsch〕是呼吸跃变型果实,成熟果实采后很快出现呼吸高峰,果肉迅速变软,大多数品种成熟季节又适逢高温高湿,果实极易腐烂变质,严重影响其销售与贮运,这是长期制约桃生产的主要问题之一。延长桃贮藏期常采用的低温冷藏等方法,易造成桃果冷害,结果并不十分理想;采用气调贮藏虽然可以降低果实的呼吸作用和乙烯的合成速率,延长桃的储运时间,但费用较高且效果较差。实践证明,通过改善贮藏的方式方法来调节桃的市场供应时间是十分困难的。通过常规育种的方法虽然有望解决,但由于桃为多年生果树,选育时间较长和种植资源的限制,很难在短时间有所突破。而利用反义基因技术,通过封闭桃果实成熟后导致软化的基因的表达,就有可能会有效延迟果实软化的时间与程度,增加储运效果,大幅度提高桃的经济价值。类似的研究已在“番茄”、“甜瓜”、“樱桃”等的种质改良中得到应用。多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁水解酶,其表达具有组织特异性,是在果实的成熟过程中合成的,在果实的软化中起重要作用。果实特异启动子(E8启动子),是乙烯应答性基因启动子,控制E8基因在果实成熟过程中特异表达。本研究以番茄品种“毛粉802”为试材,克隆了果实特异性E8启动子,以桃果肉为材料克隆了反义PG基因,为进一步利用转基因技术选育耐储性硬溶质桃新种质的研究提供了重要的实验基础,其主要研究结果为:采用高盐低pH值法,分步离心法,SDS法,CTAB法,改良CTAB法提取“毛粉802”番茄幼苗基因组DNA,其中改良CTAB法提取的DNA效果最好,以此DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,得到了预期大小的片段,将目的片段回收,克隆进pMD18-T Simple Vector载体,经PCR及酶切检测具有与目标片段长度相符的插入片段。构建的重组pMD18-E8载体经测序分析显示,番茄果实特异性E8启动子序列具有高度保守性,与GenBank上发表的E81.1启动子同源性为99.1%,成功获得了果实特异性E8启动子基因。采用Trizol法,改良Trizol法1,改良Trizol法2提取了桃总RNA,其中改良Trizol法2提取的桃果肉RNA效果最好,经过反转录PCR,扩增出一条1188bp的目的片段,而桃叶片、幼果和果皮提取的RNA通过反转录PCR,均不能获得扩增出一条1188bp的目的片段,说明PG基因在这些组织中没有或量很少。通过TA克隆,把目的片段连接到pGEM-T Vector System克隆载体上,获得重组子pGEM-PG,通过测序、分析,证明所克隆片段与GenBank上发表的PG基因序列同源性为98.57%,成功获得了反义PG基因。