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人表皮细胞生长因子(Human Epidermal Growth Factor,hEGF)是人体内的一种活性物质。hEGF不仅能刺激细胞增殖、分化和迁移,在伤口愈合、器官发生和细胞信号传导中也扮演着极其重要的角色,因此目前hEGF已被广泛应用于医药和化妆品中。鉴于hEGF的重要生理功能,所以关于hEGF生物合成受到越来越多的关注。然而由于hEGF存在3对分子内二硫键,很难实现在原核表达体系内中的可溶表达。本论文尝试不同的表达策略并通过优化表达条件来实现hEGF在大肠杆菌体内可溶性表达,并通过细胞增殖实验检测表达hEGF的活性。本研究以人源表皮细胞生长因子基因为基础构建不同的融合表达或共表达载体,使得hEGF在大肠杆菌体内实现可溶表达,从而得到具有生物活性的hEGF。具体研究内容如下:(1)利用SUMO蛋白标签与hEGF基因融合表达实现目的蛋白的可溶表达,同时与分子伴侣质粒共表达进一步提高hEGF的可溶表达量,通过SUMO蛋白酶切除SUMO得到天然的hEGF;(2)在SUMO和hEGF中间插入C端自切内含肽进行融合表达;(3)打破常规将SUMO置于hEGF基因C端进行融合表达并插入N端自切内含肽改善C端自切内含肽的体内自切现象。研究结果如下:将His-SUMO-hEGF(HSE)分别与分子伴侣(p G-KJE8、p KJE7、p Gro7、p G-Tf2、p Tf16)共表达,其中与分子伴侣p KJE7共表达的效果最好,表达条件为TB培养基,0.2 mg/ml的L-阿拉伯糖诱导分子伴侣,0.5 m M IPTG诱导His-SUMO-hEGF,25℃,180rpm培养24小时。最终His-SUMO-hEGF产量为78 mg/L,经过切除SUMO二次纯化得到具有生物活性的hEGF约为20.6 mg/L,比未诱导分子伴侣情况的产量提高了28.75%。将His-SUMO-ssp dna B-hEGF(HSSE)和SUMO-ssp dna B-hEGF-His(SSEH)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在表达条件为TB培养基,25℃,180 rpm培养24小时,均发现大量的体内自切,最终无法纯化到hEGF和hEGF-His。将hEGF-Mxe Gyr A-SUMO-His(EMSH)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在表达条件为TB培养基,0.5 m M IPTG诱导,25℃,180 rpm培养24小时情况下,在初步纯化后的融合蛋白缓冲液中添加20 m M DTT时内含肽Mxe Gyr A发生N端自剪切,最终得到具有生物活性的hEGF产量为29.4 mg/L。本课题有效地提高了hEGF的产量,降低hEGF的生产成本,并系统的研究了实现含有多个分子内二硫键的蛋白质在还原体系中的高效功能性合成的表达策略,为复杂的真核生物蛋白质在原核表达系统的高效生产提供了理论基础与设计新思路,具有一定的科研意义和社会效益。