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罗氏454公司的GSFLX测序平台,以高通量、读长长、运行速度快等(?)点,成为基因组测序中重要的技术之一。目前,全球保藏的Bt菌株大约有6000株,已有12株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)完成了全基因组测序,24株完成了精细图。因此,加大对Bt菌株的基因组序列研究尤为重要(?)Bt BRC-XQ6是由本实验分离获得的一株对李斯特菌100526具有高效的抑菌效果菌株。本文基于分子生物学、生物信息学等技术对Bt BRC-XQ6基因组序列进研究。测序结果表明,BRC-XQ6获得的读段(reads)的长度主要分布在300-6((?)bp,测序覆盖度高,预测质量较高。读段拼接得到366个重叠群(contig),总长为6541146bp,其中长度大于1000bp的重叠群共有287个,长度最大的重叠版为176946bp。利用RNAmmer和tRNAscan-SE软件在线预测,结果表明存在5s RNA 6 个、16s rRNA 1 个、23s rRNA 1 个、和 tRNA 99 个。99 个的 tRNA 共含有31类不同的tRNA,分别参与转运Met、Glu、Val、Lys、Asp、Thr、Asn等(?)种必需氨基酸。利用blast 比对工具,从Bt BRC-XQ6的基因组中预测到6991个基因中,这些基因与NCBI非冗余蛋白质数据集(NR)比对到的最佳序列的相似绝大多数超过90%,而对应基因与SwissProt库数据集的最相似序列的相似度较低。基于 http://bcam.hzaubmb.org/BtToxin_scanner/index.php,预测获得的杀虫蛋白共24个。其中Cry蛋白21个,Cyt蛋白1个,Vip蛋白2个。Cry蛋白中一级蛋白含有3个,二级蛋白2个。利用DBTBS网站(http://dbtbs.hgc.jp/)预测cry基因的转录调控因子,结果表明,设定P值=1%时,大约存在26个转录调控因子,包括:DegU、Fur、Zur、PerR、PurR、CtsR、SigF、SigE、SpoⅢD、ComK、AhrC、CodY、PerR、GlnR、GltC、GltR、Hpr、Xre、TnrA、SigH、SigG、(?)igB、AbrB、RocR、PucR、ResD。在这些转录因子中存在一类重要的物质——RNA聚合酶σ因子,包括:SigB、SigE、SigF、SigG、SigH。该类因子参与到孔子合成的各个时期中。基于http://bagel.molgenrug.nl/index.php/bagel3进行比对,获得2个预测的细菌素,分别为Colicin_Pyocin和Colicin-DNase。预测这2个组菌素的转录因子,发现Colicin_Pyocin的转录调节子是CodY,而Colicin-DNas的转录调节因子则是Fur、LevR、MntR、Mta、PucR。基因组进行注释的过程中,发现存在plcR基因,大小大约为855bp。该基因是一类多效调控因子,广泛存在在蜡状芽孢杆菌家族群中。它可以激活多种编码毒力因子的表达,如磷脂酶C等。本文针对预测获得的1个cry基因构建表达载体,针对plcR基因构建缺失载体,以期为后续研究奠定基础。利用KEGG对6991个基因分析,发现共存在179条生物学通路,涉及了微生物赖以生存的各种通路,如二元系统相关基因。运用BLAST算法(blastx/blastp 2.2.24+)将所获得的预测基因与KEGG的基因数据库(Genes)进行比对,根据比对得到的KO编号获得Cry蛋白参与的具体生物学通路。Cry蛋白中的尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(UDP-glucose 4-epimerase)与galE和pphA的代谢有关。经KEGG分析,可知与galE与果糖和甘露糖代谢间接相关,直接参与到α-D葡萄糖、α-D-6P葡萄糖、二磷酸尿核苷转化中。未发现其他的杀虫蛋白参与KEGG,这可能与测序基因组仍不完整有关。本文利用罗氏454测序技术对Bt菌株BRC-XQ6进行测序,有利于在基因组水平上了解杀虫晶体基因、细菌素表达相关基因。同时,本文初步构建了 Bt BRC-XQ6 基因缺失载体和Bt BRC-XQ6-Cry表达载体,为后续研究提供应用基础。