漆酶被誉为理想的“绿色催化剂”,在食品、医药和化工等行业广泛应用,具有重要的研究价值。白腐菌因其漆酶同工酶多、漆酶产量高和酶性质优良等特性,是主要的产漆酶微生物类群。Cu2+是白腐菌中漆酶基因表达和胞外活性最重要的诱导剂,被广泛的用于多个白腐菌菌株中的漆酶诱导表达,但截至目前对Cu2+诱导漆酶基因表达的分子机制的认识还相当有限。鉴于此,本研究以产漆酶优势耐热毛栓菌S0301菌株为研究材料,开展Cu2+对漆酶同工酶基因表达的影响及其调控机制研究,主要研究结果如下:1、Cu2+和温度对耐热毛栓菌S0301中漆酶同工酶基因表达及酶活性的影响分析实验室前期研究中完成了耐热毛栓菌S0301三代基因组测序和分析工作,该菌株中存在9个可能的漆酶同工酶。据此,本论文对9个预测的漆酶同工酶的Cu2+结合区、底物结合模块等典型漆酶特征序列进行了比对和识别,结果发现Tt Lac7、Tt Lac50和Tt Lac53等7个漆酶同工酶蛋白具有所有典型结构模块,是真正意义上的漆酶,而Tt Lac2-5和Tt Lac2-8蛋白只具有Cu2+结合区,缺乏其它结构,属于多铜氧化酶家族。GYP培养基液体发酵条件下,该菌株胞外漆酶活性的动态分析结果表明:在28℃和35℃条件下,0.5 m M以上的Cu2+均可诱导该菌株胞外总漆酶活性的增加,其中2 m M Cu2+时,在第8和第10天逐渐升高至最高值（28℃时10.6 U/m L,35℃时6.5 U/m L）。qPCR分析表明:除Tt Lac13外,Cu2+和温度能诱导6个漆酶同工酶基因和Tt Lac2-5、Tt Lac2-8的表达,其中对Tt Lac50和Tt Lac2-2诱导可提高6倍以上。2、温度和Cu2+诱导耐热毛栓菌S0301中热激转录因子TtHSF2的表达使用TtHSF2α多克隆抗体对温度和Cu2+处理后提取的总蛋白进行Western blotting分析;检测到的三个特异性蛋白条带,其分子量大小与推测的TtHSF2α,TtHSF2β-Ⅰ和TtHSF2β-Ⅱ一致。与m RNA水平上的响应模式一致,温度和Cu2+诱导TtHSF2α和TtHSF2β-Ⅰ蛋白的积累。并且在相同条件下,TtHSF2β-Ⅰ和TtHSF2β-Ⅱ在耐热毛栓菌S0301中均比TtHSF2α占优势,但是Cu2+和温度对TtHSF2β-Ⅱ蛋白积累的影响无规律性。系统进化树分析发现TtHSF2α与拟南芥（Arabidopsis thaliana）热激转录因子At HSFA3进化关系最近。3、TtHSF2参与漆酶同工酶基因表达调控的机制分析在前期建立同核耐热毛栓菌S0301菌株遗传转化体系的基础上,本研究优化并选取柠檬酸合酶的启动子（Tt CS2P）构建过量表达质粒,获得稳定遗传的TtHSF2α、TtHSF2β-Ⅰ过量表达和TtHSF2反义抑制菌株,并完成转化子DNA、m RNA和蛋白质水平的检测。分别对TtHSF2α、TtHSF2β-Ⅰ过量表达和TtHSF2反义抑制菌株胞外漆酶活性进行测定,对TtHSF2β-Ⅰ过量表达和TtHSF2反义抑制菌株中漆酶同工酶转录水平进行检测。结果显示TtHSF2α和TtHSF2β-Ⅰ对耐热毛栓菌S0301菌株中漆酶活性有相反的影响;过表达TtHSF2β-I的菌株在第6天和第8天的酶活性分别是对照的1.6倍和2.3倍,而过量表达TtHSF2α的菌株的酶活约为对照的33.2%和36.2%。并且热稳定性分析显示过量表达TtHSF2β-I的菌株的粗漆酶比过表达TtHSF2α的菌株更稳定。qPCR结果显示过表达TtHSF2β-I可上调除Tt Lac53外的所有漆酶同工酶的表达;在不含Cu2+的GYP培养基中,TtHSF2β-I对Tt Lac13转录水平的影响达到对照的5.9倍（最高）,对Tt Lac16转录水平的影响达到1.4倍（最低）。在过表达TtHSF2β-I的菌株中添加2 m M Cu2+后,Tt Lac50的转录显著增加了10.6倍。另外,在不含Cu2+的GYP培养基中,Tt Mco2-5和Tt Mco2-8的转录受TtHSF2β-I的影响是对照的1.8倍和1.7倍。与此同时,TtHSF2反义抑制菌株在转录水平或酶活水平都显示出与TtHSF2β-Ⅰ过表达菌株相反的结果,抑制倍数最大的为Tt Lac7,达到3.4倍。重要的是,EMSA实验发现TtHSF2α可以与Tt Lac1和Tt Lac13两个漆酶启动子上的HSE元件特异性结合,并且Y1H实验显示出TtHSF2α可以在酵母中与Tt Lac13的启动子结合,这也是证明TtHSF2作为漆酶活性的直接调节剂最直接的证据。除此之外,Y2H实验揭示TtHSF2α可以与TtHSF2β-I发生相互作用,并且TtHSF2β-I蛋白中因可变剪接产生的13个氨基酸对相互作用没有影响。4、TtHSF2对耐热毛栓菌锰过氧化物酶（Mn Ps）活性及转录的影响在TtHSF2表达量改变的菌株中锰过氧化物酶的活性发生显著改变,TtHSF2β-I过表达菌株中锰过氧化物酶的表达量明显增多,而TtHSF2α过量表达菌株和TtHSF2反义抑制菌株则是受到了抑制。转录水平分析发现TtHSF2β-I过表达导致了大多数锰过氧化物酶表达量的显著提高。相反,TtHSF2α过量表达导致耐热毛栓菌S0301中锰过氧化物酶表达的抑制,TtHSF2反义抑制菌株中得到与TtHSF2α过量表达相似的结果。5、TtHSF2参与耐热毛栓菌的氧化应答已有研究表明大豆疫霉Ps HSF1调控胞外过氧化物酶和漆酶对植物防御过程中产生的ROS解毒。本研究考察了TtHSF2表达量改变菌株对双氧水胁迫的表型,发现TtHSF2α和TtHSF2β-I剪接亚型在耐热毛栓菌S0301中呈现相反的功能,TtHSF2β-I过量表达菌株对双氧水胁迫的敏感性降低,而TtHSF2α过量表达菌株则相反。通过转录组分析了TtHSF2β-I过量表达菌株在双氧水胁迫下耐热毛栓菌S0301中抗氧化相关转录因子、抗氧化酶、氧化应激相关蛋白、细胞壁和细胞膜组分相关基因表达谱的变化,揭示了双氧水胁迫影响到核糖体组装、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢和氧化磷酸化等通路。综上所述,本研究完成了Cu2+和温度对耐热毛栓菌S0301中漆酶同工酶基因表达及酶活性的影响分析,初步阐明了Cu2+诱导热激转录因子TtHSF2在漆酶同工酶表达调控中的分子机制,发现TtHSF2表达量改变对锰过氧化物酶基因家族的调控效应,及TtHSF2参与双氧水胁迫耐受的可能机制,为进一步研究TtHSF2调控耐热毛栓菌S0301中木质素降解酶系的分子机制提供了可能,丰富了HSF转录因子的功能研究,同时也为提高白腐菌漆酶等木质素降解酶产量及推动其产业化应用奠定基础。本研究的创新点:1、本文以Trametes属中产漆酶优势的耐热菌株毛栓菌T.trogii S0301为出发材料,探究漆酶同工酶表达及酶活性调节受Cu2+调控的分子机制,通过转录因子的遗传操作开展漆酶同工酶的表达调控研究,为提高菌株漆酶产量和不同类型的漆酶同工酶诱导表达提供理论证据。2、本文揭示了Cu2+响应转录因子TtHSF2在耐热毛栓菌漆酶同工酶表达、锰过氧化物酶表达和双氧水胁迫中的功能和可能的机制,丰富了真菌HSF转录因子的生物学功能研究。