【摘 要】
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涝渍灾害是限制玉米产量提高的主要因素之一。现有研究表明,ERF类转录因子,特别是ERF第七亚家族转录因子在植物涝渍胁迫调控中扮演着重要角色。实验室前期通过候选基因关联分析发现玉米ERF第七亚家族基因（ERFVIIs）与渍水抗性显著相关;另外利用耐渍QTL定位结合转录组数据分析鉴定到ERF第五亚家族转录因子ZmEREB46也参与渍水胁迫响应。本研究在此基础上,对多个玉米ERF家族基因进行生物信息学分
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涝渍灾害是限制玉米产量提高的主要因素之一。现有研究表明,ERF类转录因子,特别是ERF第七亚家族转录因子在植物涝渍胁迫调控中扮演着重要角色。实验室前期通过候选基因关联分析发现玉米ERF第七亚家族基因（ERFVIIs）与渍水抗性显著相关;另外利用耐渍QTL定位结合转录组数据分析鉴定到ERF第五亚家族转录因子ZmEREB46也参与渍水胁迫响应。本研究在此基础上,对多个玉米ERF家族基因进行生物信息学分析和表达模式分析,并在拟南芥中异位超表达,通过转化后代的表型鉴定初步明确关键ERF基因的功能;进而利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建ERF家族基因玉米突变材料,为相关候选基因功能和遗传机理的深入研究夯实基础。研究结果如下:1.ZmERFVIIs生物信息学分析和表达分析。19个ZmERFVIIs均具有AP2/ERF结构域,其中13个ZmERFVIIs有N端保守motif MCGGAI（I/L）。ERFVIIs在不同物种间存在遗传进化上的差异。ZmERFVIIs启动子含有厌氧、干旱、低温等非生物胁迫响应元件,以及脱落酸、赤霉素、生长素等激素响应元件。玉米B73苗期渍水处理不同时期根尖转录组数据分析结果表示,19个ZmERFVIIs中,ZmEREB167、ZmEREB210和ZmEREB139在根尖均无表达,其他16个ZmERFVIIs均受渍水胁迫诱导上调表达,但表达模式存在差异。2.ZmEREB46生物信息学分析和表达分析。ZmEREB46在高世代重组自交系A3237和A3239中重测序结果表明,在编码区存在一个SNP差异导致丙氨酸（A3237）变为苏氨酸（A3239）,在A3237启动子区存在911bp片段插入。利用荧光定量PCR（q RT-PCR）分析ZmEREB46在A3237和A3239中的表达模式,表明ZmEREB46受渍水胁迫诱导上调表达,渍水处理8h后ZmEREB46在A3237中的表达量是A3239中的2倍。双分子荧光素酶实验结果证实ZmEREB46A3237启动子活性是ZmEREB46A3239的2.5倍。亚细胞定位结果显示ZmEREB46表达蛋白定位在细胞核中。3.8个ERF转录因子拟南芥异位超表达均能显著提高苗期耐淹性。通过农杆菌侵染拟南芥花序法成功创制了8个ERF基因的异位超表达材料,进行半定量检测确定每个基因获得4个及以上阳性转化事件。利用DAB染色、MDA含量、存活率、干重四个指标,对野生型和阳性拟南芥进行苗期淹水鉴定,四个指标鉴定结果均表明8个ERF基因的异位表达都能在不同程度上显著提高拟南芥苗期的耐淹性。4.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制玉米ERF突变体。构建CRISPR敲除载体对17个玉米ERF转录因子在B104背景下进行批量编辑敲除,通过对T0和T1代遗传转化后代进行编辑类型检测,目前已获得7个ERF基因的阳性CRISPR编辑事件,且每个基因有2种以上编辑类型,获得的阳性编辑后代为后续各个ERF基因的耐渍功能研究提供了很好的材料。5.8个ERF转录因子与顺式作用元件结合能力分析。通过双分子荧光素酶实验,判断ERF家族转录因子与GCC-Box（GCCGCC）和DRE-Box（A/GCCGAC）的结合能力,结果发现ZmEREB116不能结合两种顺式元件;ZmEREB160能与GCC-Box结合,不能与DRE-Box结合;其余转录因子都能结合GCC-Box和DRE-Box两种顺式元件。上述实验结果表明,ERF转录因子可能通过结合GCC-Box和DRE-Box,调控下游渍水胁迫相关基因的表达,提高玉米苗期耐渍性。
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