目的:铁死亡(Ferroptosis)是一种新的调节性细胞死亡形式,是铁离子依赖的脂质过氧化物(Lipid reactive oxygen species,lipid ROS)累积到致死水平所导致的细胞死亡。铁死亡不能被凋亡抑制剂如坏死稳定素(Necrostatin-1)或自噬抑制剂如氯喹(Chloroquine)抑制,但是可被铁离子螯合剂如去铁胺(Deferoxamine)或者合成的抗氧化剂如ferrostatin-1抑制。铁死亡主要涉及铁离子代谢、脂质过氧化以及system Xc--GSH-GPX4轴。细胞内铁离子稳态与细胞对铁离子的吸收、排出和存储有关。细胞内铁离子调节蛋白的失调会导致细胞内Fe2+过量的积累并通过Fenton反应促进lipid ROS产生。System Xc-是一种广泛存在于磷脂双层膜中的氨基酸转运蛋白,溶质载体家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)编码的轻链是system Xc-特有的亚基,且SLC7A11的表达水平通常与system Xc-的活性呈正相关。细胞通过system Xc-摄取细胞外胱氨酸用于合成谷胱甘肽(Glutathione,GSH)。谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)将还原型谷胱甘肽转化为氧化型的同时清除细胞内lipid ROS。铁死亡可以通过药理学或遗传学方式进行调节,诱导铁死亡杀灭肿瘤细胞是一种新的抗肿瘤治疗策略。小分子化合物erastin、sorafenib等可直接抑制system Xc-活性,导致细胞内GSH耗竭以及随后铁离子依赖的lipid ROS增加,最终诱导细胞铁死亡。一些研究表明,肿瘤细胞中相关基因或分子的改变可影响诱导性药物对铁死亡的诱导作用,如激活转录因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)与SLC7A11启动子紧密结合抑制其表达,进而抑制system Xc-活性促进erastin诱导的铁死亡。深入研究药物诱导铁死亡的影响因子,对于肿瘤治疗具有重要意义。生长分化因子15(Growth differentiation factor 15,GDF15)属于TGF-β超家族成员。已有研究报道,胃癌等肿瘤患者血清或癌组织中GDF15水平升高,并且GDF15水平升高与肿瘤患者预后不良相关,表明GDF15可能是一个可靠的肿瘤进展预测指标。细胞生物学研究表明,GDF15影响肿瘤细胞凋亡、侵袭转移等特性。本课题组前期研究发现GDF15促进胃癌细胞MGC803的干样特性。上述结果表明,GDF15在胃癌等多种肿瘤中发挥十分重要的作用,但其作用机制尚不明确。有研究表明,GDF15与铁调素(Hepcidin)的水平有关,并且调节铁调素的表达,而铁调素可导致铁转运蛋白(Ferroportin)的降解。在患有噬红细胞性淋巴组织细胞增多症儿童的外周血细胞中,GDF15 mRNA表达与铁转运蛋白和铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain 1,FTH1)m RNA表达正相关。上述结果提示,GDF15可能参与细胞内铁离子代谢的调节,而铁离子是铁死亡的关键调节因子。因此我们推测GDF15可能在铁死亡中发挥作用。为证实以上推测,我们首先研究常用的铁死亡诱导剂erastin是否诱导人胃癌细胞系MGC803和SGC7901铁死亡。然后通过细胞水平实验,研究敲低GDF15对erastin诱导的胃癌细胞铁死亡的影响;再通过裸鼠移植瘤实验,研究敲低GDF15对erastin抗肿瘤活性的影响。最后我们将研究GDF15发挥作用的机制。希望通过本研究认识GDF15在erastin诱导的胃癌细胞铁死亡中的作用及其分子机制,为靶向铁死亡治疗胃癌提供新的靶点。研究方法:1、Erastin和ferrostatin-1共同处理证实erastin是否诱导人胃癌细胞系MGC803和SGC7901细胞铁死亡。2、GDF15特异性sh RNA转染MGC803和SGC7901细胞,实时定量PCR检测GDF15以及铁死亡相关基因mRNA表达;Western blotting检测GDF15和SLC7A11的蛋白表达。3、ATF3特异性siRNA转染MGC803,实时定量PCR和Western blotting分别检测ATF3、SLC7A11 m RNA和蛋白表达。4、Co-IP实验检测ATF3和GDF15蛋白相互作用。5、GDF15 RNAi慢病毒转染,构建GDF15敲低MGC803细胞系并移植到BALB/c小鼠,成瘤后腹腔注射erastin,记录肿瘤大小并拍照。6、CCK-8实验检测细胞活性。7、谷氨酸检测实验检测培养基中谷氨酸含量。8、谷胱甘肽检测实验检测细胞内谷胱甘肽含量。9、流式细胞术检测细胞内脂类过氧化物积累。10、倒置荧光显微镜观察细胞状态。结果:1、Erastin处理MGC803和SGC7901细胞后,细胞活性随erastin浓度增加而降低(P<0.05),ferrostatin-1可挽救erastin诱导的MGC803和SGC7901细胞活性降低。2、Erastin处理条件下,GDF15敲低组的MGC803和SGC7901细胞活性显著低于对照组(P<0.01)。3、Erastin处理条件下,GDF15敲低组的BALB/c小鼠肿瘤体积显著低于对照组肿瘤体积(P<0.05)。4、敲低MGC803细胞中GDF15后,SLC7A11 m RNA和蛋白表达均显著降低(P<0.001)。5、Erastin处理条件下,MGC803细胞中GDF15和SLC7A11的m RNA和蛋白表达显著增高(P<0.05)。6、敲低GDF15可抑制erastin诱导的MGC803细胞中GDF15和SLC7A11蛋白表达升高(P<0.05)。7、敲低GDF15使MGC803细胞外培养基中谷氨酸含量显著减少,细胞内GSH含量显著降低,Lipid ROS积累显著增加(P<0.05)。8、敲低GDF15促进了erastin诱导的MGC803细胞外培养基中谷氨酸含量减少,细胞内GSH含量降低以及Lipid ROS积累(P<0.01)。9、敲低MGC803细胞中ATF3后,SLC7A11 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.001)。10、GDF15蛋白和ATF3蛋白相互结合。结论:1、敲低GDF15促进erastin诱导的MGC803和SGC7901细胞铁死亡,以及裸鼠体内erastin的抗肿瘤活性。2、敲低GDF15通过抑制SLC7A11表达和system Xc-功能,促进erastin诱导的MGC803细胞铁死亡。3、ATF3调控SLC7A11表达,并且与GDF15蛋白相互作用。