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土壤盐渍化是我国农林业生产面临的主要环境问题之一。提高树木耐盐性对于盐碱地带的造林绿化和生态环境建设至关重要。胡杨(Populus euphratica)是研究陆生木本植物耐盐机制的模式树种。在高盐环境下,胡杨能维持体内的K+/Na+平衡和活性氧平衡,其中质膜H+-ATPases发挥了十分重要的调节作用。胡杨质膜H+-ATPases促进Na+外排并减少K+的流失。此外,质膜H+-ATPases还参与了盐胁迫下胡杨H2O2信号的传导。实验室近期研究发现,胡杨耐盐信号转导途径可能还包括RIN4蛋白复合体:RIN4蛋白复合体通过激活质膜H+-ATPases,进而调控细胞离子平衡和活性氧平衡。质谱研究结果表明,拟南芥RIN4蛋白复合物包含remonn蛋白和jacalin类凝集素。已有报道显示,remorin蛋白和jacalin类凝集素在植物抵御生物胁迫过程中具有重要的作用,但它们在植物响应非生物胁迫中的作用鲜有报道。本文旨在揭示胡杨remorin蛋白和jacalin类凝集素调控盐胁迫信号传导的分子机制。本文通过酵母双杂交等技术研究了胡杨remorin家族蛋白PeREM6.5、PeREM1.3和jacalin类凝集素PeJRL蛋白与胡杨PeRIN4蛋白之间的相互作用;通过在模式植物中过表达目的基因,解析了 PeREM6.5、PeREM1.3和PeJRL调控植物耐盐性的作用机制。本文得到以下主要结果:1.胡杨PeREM6.5是一种remorin蛋白,能够响应盐胁迫。PeREM6.5编码基因具有1130bp开放阅读框(ORF),编码370个氨基酸。酵母双杂结果证明了 PeREM6.5和PeRIN4之间的相互作用。通过体外酶促实验证明了 PeREM6.5能够与PeRIN4互作调控胡杨质膜H+-ATPases的活性。为深入研究PeREM6.5响应盐胁迫的分子机制,本文克隆了胡杨PeREM6.5基因并将其转化到拟南芥(Col-0)中。过表达PeREM6.5能显著提高转基因拟南芥的耐盐性,具体表现在:PeREM6.5提高了转基因株系的存活率和根长,同时降低膜透性和MDA含量。在盐胁迫下,转基因植物能维持质膜H+-ATPases活性,进而增强植物维持离子平衡和活性氧平衡的能力。非损伤微测技术(NMT)测定了根尖的动态离子流,转基因植物能降低K+流失并减少Na+的积累,主要是PeREM6.5激活了 Na+/H+逆向转运体系(质膜H+-ATPases、Na+/H+逆向转运蛋白)、同时降低了质膜上KORCs(去极化激活的外向型K+离子通道)的活性。此外,过表达PeREM6.5提高了拟南芥中抗氧化酶的活性,从而能够在盐胁迫下维持活性氧平衡。综上所述,PeREM6.5通过激活质膜H+-ATPases增强植物耐盐性。2.胡杨remorin家族中的另一个成员PeREM1.3受盐与渗透胁迫诱导。PeREM1.3与拟南芥中RIN4蛋白复合物中的remorin蛋白REM1.2(At3G61260)同源性最高。然而,酵母双杂交结果表明PeREM1.3和PeRIN4之间没有发生相互作用。为深入研究PeREM1.3介导的耐盐机制,本文克隆了胡杨PeREM1.3基因,并将35S::PeREM1.3在烟草中异源表达。PeREM1.3编码基因具有600bp开放阅读框(ORF),编码199个氨基酸。研究表明,PeREM1.3蛋白定位于质膜上,过表达PeREM1.3能够提高转基因烟草的耐盐性。在盐胁迫下,过表达PeREM1.3的转基因株系显著提高了抗氧化酶如SOD、POD和CAT的活性,从而维持植物细胞的ROS平衡。另外,转基因株系中胁迫响应基因(如SOS1、HAK、NHA1、VAG1和PMA4)的转录水平显著升高,这有助于盐处理下植物调控K+/Na+平衡。以上结果说明PeREM1.3蛋白同PeREM6.5类似,也能通过维持植物的ROS平衡和K+/Na+平衡提高耐盐性。3.盐胁迫能够诱导胡杨叶片、根系和愈伤组织中甘露糖结合jacalin类凝集素(PeJRL)基因的表达。PeJRL编码基因具有1338 bp开放阅读框(ORF),编码445个氨基酸。亚细胞定位结果显示PeJRL位于细胞质中。酵母双杂交结果表明,PeJRL和PeRIN4之间未发生相互作用。为深入研究PeJRL在耐盐性中的作用机制,本文从胡杨中克隆了PeJRL基因,并将其转化至拟南芥(Col-0)中。实验结果表明,PeJRL能够提高拟南芥的存活率和根长、同时降低电解质渗漏,从而提高转基因植物的耐盐性。在盐胁迫下,转基因植物能够减少K+的流失并限制Na+的积累。离子流数据显示,过表达PeJRL能够提高转基因株系的Na+外排能力,这与质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)和质子泵编码基因AHA1和AHA2的上调有关。过表达PeJRL能够间接激活植物中质膜H+-ATPase的活性,从而限制了由NaCl诱导的去极化激活的离子通道介导的K+流失。PeJRL转基因拟南芥还能够通过激活抗氧化酶,下调质膜NADPH氧化酶基因的表达来减少O2-的产生从而维持ROS平衡。此外,过表达PeJRL能够抑制转基因拟南芥中ABA的生物合成,在盐胁迫下减轻了由ABA诱导产生的活性氧所造成的氧化损伤。