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第一部分:缺氧诱导因子-1α在胰腺组织中的mRNA表达与胰腺癌生物学特征的关系目的初步探讨缺氧诱导因子-1α在胰腺癌中mRNA水平的表达与胰腺癌的血管形成、胰腺癌细胞的增殖、分化和转移等生物学特性之间的关系。方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测缺氧诱导因子-1α在胰腺癌的癌组织和癌旁组织中mRNA水平的表达,采用免疫组织化学SP法检测survivin、PCNA和CD34在胰腺癌组织中的表达水平。统计学分析用SPSS 12.0统计软件进行各组缺氧诱导因子-1α表达水平的方差分析、配对t检验、两样本t检验并用Spearman相关关系和简单线性相关关系分析以明确缺氧诱导因子-1α表达水平与survivin、PCNA、CD34表达之间的关系。结果缺氧诱导因子-1α在胰腺癌的癌与癌旁组织中mRNA水平的表达差异有统计学意义.缺氧诱导因子-1α的表达水平在不同分化程度的肿瘤细胞中的差异无统计学意义。JPS分期STAGEⅠ-Ⅱ和STAGEⅢ-Ⅳ两组的缺氧诱导因子-1α表达水平的差异有统计学意义。缺氧诱导因子-1α的表达与肿瘤细胞的增殖、凋亡和肿瘤的血管形成等生物学行为相关的三个指标即PCNA、survivin、CD34的表达之间密切相关。结论缺氧诱导因子-1α的表达水平与胰腺癌的血管形成、胰腺癌细胞的增殖、凋亡和转移等的关系有统计学意义。关键词缺氧诱导因子-1α;胰腺癌;RTPCR;免疫组织化学第二部分:体外实验:应用RNA干扰技术研究缺氧诱导因子-1α在胰腺癌细胞的增殖、凋亡和转移过程中的作用目的探讨缺氧对胰腺癌细胞增殖、凋亡和转移的影响以及缺氧诱导因子-1α在这个过程中所发挥的作用并探讨靶向缺氧诱导因子-1α作为胰腺癌治疗方法的可能性。方法构建了缺氧诱导因子-1α的siRNA表达载体,并进行胰腺癌细胞的转染,通过该质粒使得胰腺癌细胞内的缺氧诱导因子-1α的表达抑制,再用MTT法测定在缺氧和常氧状态下绘制胰腺癌细胞(缺氧诱导因子-1α的表达受抑制和未受抑制的胰腺癌细胞)的生长曲线;利用Annexin V-PE和7AAD双标记试剂盒对细胞进行标记,并通过流式细胞仪检测细胞凋亡;用Transwell测细胞转移能力;最后RT-PCR和Westrnblot方法检测缺氧诱导因子-1α、survivin、VEGF、NM23a、促血管生成素-1和细胞增殖核抗原(PCNA)的表达情况。结果在缺氧状态下,胰腺癌细胞生长增快,凋亡减少、转移能力增加并均有统计学意义,同时缺氧诱导因子-1α、PCNA、survivin和VEGF表达增加,而促血管生成素-1(angiopoietin-1)和nm23a表达减少。转染缺氧诱导因子-1αsiRNANA表达载体后,胰腺癌细胞对于缺氧的适应性下降,表现出与转染前缺氧时相反的效应并有统计学意义。结论缺氧诱导因子-1α可能与缺氧状态下胰腺癌细胞的一系列适应性反应密切相关。缺氧诱导因子-1α具有成为胰腺癌治疗有效靶分子的潜力。第三部分:体内实验:建立胰腺癌的种植瘤模型和转移模型进一步研究缺氧诱导因子-1α对于胰腺癌生物学特征的影响目的在第二阶段的研究结果基础上,通过建立体内肿瘤模型进一步探索缺氧诱导因子-1α作为胰腺癌治疗靶分子的有效性。方法对胰腺癌细胞进行缺氧和质粒转染两种干预处理,再应用各细胞株建立裸鼠皮下种植肿瘤模型和尾静脉转移模型,四周后观察成瘤大小和肝脏、肺内的转移情况。将取得的肿瘤、肝脏和肺组织标本制成石蜡块,通过免疫组织化学方法检测各组织中缺氧诱导因子-1α、细胞增殖核抗原、survivin、CD34表达,并用TUNEL法检测凋亡率。结果/相比于转染缺氧诱导因子-1αsiRNA表达载体的胰腺癌细胞,未转染质粒的胰腺癌细胞经过缺氧处理后,其成瘤体积、转移灶数目和大小明显增加,缺氧诱导因子-1α、细胞增殖核抗原、survivin和CD34表达上调并有统计学意义,稳定转染对照质粒(pGenesil-1-HK)的胰腺癌细胞所形成的肿瘤组织中,常氧培养者凋亡率没有缺氧培养者高,两者差异有统计学意义。而转染缺氧诱导因子-1αsiRNA表达载体后,其致瘤性明显下降,成瘤体积小,转移能力下降有统计学意义,即转移灶数目和大小明显降低。而上述各分子表达明显下调。各转移灶中的凋亡率差别无统计学意义。结论本实验结果表明缺氧诱导因子-1α表达抑制后,胰腺癌细胞的致瘤性和增殖、转移能力下降并有统计学意义,提示缺氧诱导因子-1α可能是胰腺癌靶向治疗的强效靶分子。