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研究背景和目的PTEN蛋白由抑癌基因PTEN编码,具有蛋白磷酸酶和脂磷酸酶双重活性。PTEN通过对PIP3和FAK等底物的去磷酸化作用,抑制肿瘤细胞生长、侵润和迁移,促进凋亡。PTEN基因在多种肿瘤中存在广泛的基因突变、启动子甲基化、PTEN蛋白泛素化、氧化、磷酸化等负向调节,致使PTEN在多种肿瘤细胞中存在功能降低甚至缺失。本实验构建了pLenti6/V5-PTEN载体,通过转染LOVO和HepG2细胞,干预两种细胞内PTEN蛋白的表达,为进一步研究PTEN的功能和在肿瘤中的作用奠定基础。方法1、构建pLenti6/V5-PTEN载体：提取人外周血白细胞RNA, RT-PCR扩增PTEN全长基因。用XhoⅠ和BamH I对PTEN基因和载体DNA进行双酶切,连接重组成pLenti6/V5-PTEN载体。pLenti6/V5-PTEN载体转化大肠杆菌,筛选氨苄抗性克隆进行菌落PCR,阳性菌株外送测序鉴定。2、培养LOVO结肠癌细胞、HepG2肝癌细胞。3、pLenti6/V5-PTEN载体的转染和表达：扩培成功转化pLenti6/V5-PTEN载体的菌株并提取PTEN质粒,将载体加入已培养至合适密度的细胞培养孔中,每组实验包括空白对照、阴性质粒对照、阳性质粒。分别提取转染24h和48h的细胞内容物,RT-PCR检测PTEN的mRNA表达水平,Western Blot检测蛋白表达水平。结果重组的pLenti6/V5-PTEN表达载体测序结果正确。与对照组相比,转染LOVO和HepG2细胞后48h可以检测到PTEN的mRNA和蛋白表达量均升高。转染后细胞与转染前细胞相比,生长缓慢,长满培养瓶的时间延长。结论成功构建了pLenti6/V5-PTEN表达载体；该表达载体在LOVO和HepG2细胞中上调了PTEN mRNA和蛋白的表达,说明pLenti6/V5-PTEN具有转录活性：转染后的细胞生长缓慢,与PTEN蛋白功能一致,说明转录产物保持了应有的生物活性。