目的：骨髓组织中含有两种干细胞成分即造血干细胞和骨髓间充质干细胞。骨髓中的间充质干细胞不仅能产生造血细胞的微环境，辅助骨髓造血，而且还可以分化成各种胚层细胞，它以无可比拟的优越性成为组织工程种子细胞的理想来源。本实验采用Percoll密度梯度离心、贴壁筛选法及单克隆培养法，分离、培养、扩增出高度同源性的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），建立MSCs体外分离、培养体系，探讨大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性，并将其向成骨细胞定向诱导分化为进一步的研究其作为骨组织工程的种子细胞打下基础。骨髓间充质干细胞（MSCs）位于骨髓的基质细胞系中，在体外可以通过贴壁培养加以分离，由于其分裂增殖能力强，可以分化为多种结缔组织细胞，形成骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪、神经等，并易于被外源基因转染并稳定表达。　　 现在临床患者中以各种原因引起的骨组织缺损或不同疾病侵蚀所造成的骨损伤，医务工作者急待有新的治疗方法的出现，改善目前临床上常用死骨摘除、假体置换等等方法治疗，对一些患者来说，这些疗法损伤较大且疗效不甚理想，并有一定的经济负担，不少患者放弃手术而采取中药保守治疗。在重大的责任压力面前，研究者们不断研究探索，采用骨髓分离细胞加以纯化，增殖培养等方法，对极少量的骨髓间充质干细胞进行扩增，药物诱导，结果可得到大量较纯的骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞。为临床开辟了治疗骨缺损后新的、有效的治疗方法。　　 骨髓中MSCs含量虽然很少，约占骨髓内单核细胞总数的1/104～1/105，并随年龄增加而减少，但MSCs取材方便，有强大的分化潜能，可以在体外扩增，由它诱导的组织细胞进行移植时不存在组织配型和免疫排斥反应。因此，在骨组织工程学中，骨髓间充质干细胞（MSCs）成为研究骨缺损和骨坏死修复的热点。　　 本实验旨在通过研究建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养方法体系，探讨其向成骨细胞分化的最佳诱导条件，为今后的进一步动物实验以及未来用于人类骨科疾病的临床治疗奠定基础。　　 方法：大鼠断颈处死，无菌条件下，取股骨和胫骨的骨髓腔内的骨髓，采用Percoll（1.073g/ml）密度梯度离心和贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞作为原代细胞，将其置于37℃，饱和湿度5％ CO2的常规条件下培养，选择P2代细胞，待进入对数生长期后用于实验。　　 1.MSCs原代细胞培养：SD大鼠，体重在70～80g左右，断颈处死，在75％的乙醇中浸泡5分钟，四肢固定于蜡盘上，碘酒消毒，剪开下腹部皮肤，暴露出股骨和胫骨，尽量剔除干净骨膜和软组织，剪开骨头两端，露出骨髓腔。用肝素-Hanks混合液（1：9）冲洗骨髓腔，反复数次。收集此骨髓液按1：1的体积比加于密度为1.073g/ml的Percoll分离液上层。以2000转/分钟转速离心20分钟，吸取液面交接处的单个核细胞。用Hanks悬浮细胞，2000转/分钟离心10分钟，反复2次。吸去上清液后用含20％FBS的DMEM悬浮细胞，调整细胞浓度为1×105/m，接种于25ml塑料培养瓶。每日镜下观察细胞生长情况。　　 2.MSCs的鉴定：包括形态学观察，细胞周期的检测，流式细胞术细胞表面分子的检测（CD44、CD34），细胞增殖率检测（细胞生长曲线），甲苯胺蓝染色。　　 3.诱导培养MSCs向成骨细胞分化：取P2代MSCs，按密度为5×105/ml接种于6孔板中，按加入诱导剂中地塞米松浓度不同（1×10-7mol/L和1×10-8mol/L）分为2个实验组和1个常规培养的对照组进行培养，隔日换培养液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况。　　 4.成骨诱导分化后的鉴定：包括形态学观察，Giemsa染色法，碱性磷酸酶（ALP）染色和活性测定，Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色，茜素红钙节结染色。　　 结果：1.骨髓间充质干细胞（MSCs）的培养与观察原代MSCs细胞接种后2～3天，倒置显微镜下可见单个细胞贴壁生长，3天后首次换液，部分细胞形成集落，增殖迅速，成放射状向周围扩展。以后隔日换液一次，培养至12～14天，达到80％～90％融合，呈旋涡状或束状排列。而且位于培养瓶边缘的细胞密集，长势优于中央部位的细胞集落，即出现细胞边聚现象；细胞呈纺锤形、梭形、多角形等，细胞间界限清晰，胞浆饱满，胞核圆形，居中或偏于细胞一侧，单个或多个核仁，生长期细胞分裂相多见。细胞传代至4代后，细胞增长速度减慢、细胞体积增大，胞浆折光度减弱、开始出现小空泡，提示细胞老化。　　 2.MSCs成骨诱导和细胞形态观察 MSCs经成骨诱导后，细胞形态由长梭形逐渐变为多边形或三角形；胞浆丰富，并伸出多个细而短的突起于周围细胞相连，胞核大而清晰，呈圆形或卵圆形，1～3个核仁。细胞可复层生长，形成细胞结节甚至团块状。　　 3.MSCs细胞周期的检测取第2代MSCs，胰酶消化后制成细胞悬液，收集大约1×106个细胞，流式细胞仪检测。G0/G1期的细胞为80.33％，G2期的细胞为2.62％，S期的细胞为16.95％，大部分细胞处于静止期，只有少数细胞处于活跃的增殖期，符合干细胞的特征。　　 4.MSCs表面分子的检测流式细胞仪显示CD44阳性率为96.37％，CD34阳性率为5.8％，　　 5.MSCs的生长曲线从生长曲线上可以看出MSCs生长潜伏期为1～3天，第3～4天进入对数增殖期，5～6天进入平台期。　　 6.甲苯胺蓝染色后，MSCs细胞呈长梭形或三角型，胞浆呈蓝色，胞核呈淡蓝色，单个或2～3个核仁，清晰，呈深蓝色　　 7.MSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）染色（Gomori钙钴法），成骨细胞胞质中呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。　　 8.MSCs成骨诱导后钙化结节染色（茜素红法）后，肉眼见钙化结节呈现不同的红色团块。　　 9.MSCs成骨诱导后Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色细胞核周围呈黄褐色着色　　 10. MSCs成骨诱导后Giemsa染色法，见胞浆丰富染成粉红色，细胞核染成紫蓝色，呈圆形或卵圆形，位于细胞中央或偏向一侧，核仁明显。　　 11.诱导培养第3、6、9、12天的碱性磷酸酶活性（A405）测定，地塞米松浓度1×10-7组和1×10-8组与对照组比较均有显著性差异，p<0.05。两种地塞米松浓度组间比较无显著性差异。　　 结论：1.用Percoll细胞分离液进行密度梯度离心可以获得比较纯的原代骨髓间充质干细胞。对骨髓间充质干细胞的鉴定可以通过形态学及生长特性的观察；流式细胞仪检测其细胞表面的分子标志；在一定条件下可以多向分化等。　　 2.MSCs由两种地塞米松浓度（1×10-7mol/L，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/ml维生素C和1×10-8mol/L，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/ml维生素C）的诱导剂诱导，均能分化成成骨细胞，两种浓度Dex诱导效果无显著性差异。　　 3.MSCs成骨诱导后的鉴定可通过形态学和生长特性的改变，碱性磷酸酶（ALP）染色和活性测定，Ⅰ型胶原的免疫组织化学染色，茜素红钙节结染色。　　 4.MSCs经由两种浓度的地塞米松的成骨诱导剂诱导7～9天可出现碱性磷酸酶染色阳性，20天后可出现茜素红钙节结染色阳性。