论文部分内容阅读
目的:本研究以在新疆北疆部分地区分离得到的9株牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）为研究对象,在确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的Pm流行的血清型及ST型的基础上,筛选出1-2株毒性强、免疫原性好、疫苗保护率高的牛源A型Pm菌苗候选株,用于后期Pm菌苗的研究。方法:（1）采集病料按照常规方法分离培养细菌,对分离菌株进行生化鉴定、16S rRNA及Pm特异性鉴定基因Kmt的PCR鉴定,采用荚膜、脂多糖多重PCR及MLST分型方法对Pm分离株进行分型,初步确定从新疆北疆部分地区疑似病例中分离的Pm主要血清型及ST型。（2）采用PCR方法检测9株牛源Pm分离株的7类25个毒力基因、12类22个耐药基因的分布情况;采用纸片扩散法（K-B法）对9株牛源Pm分离株进行20种药物的敏感性测定;以相同剂量人工感染小鼠筛选强毒株并采用寇氏法测定强毒分离株小鼠半数致死量(LD50);制作病理切片观察被Pm感染死亡小鼠肺脏、肝脏、脾脏的病理学变化。（3）将筛选出的4株Pm分别增菌培养,浓缩至所需要的浓度,0.4%甲醛灭活10h后乳化制备成灭活菌苗;采用间接ELISA方法检测菌苗免疫小鼠后连续5周内产生的抗体水平;采用免疫攻毒保护试验测定4组Pm菌苗对小鼠的免疫保护率;感染死亡小鼠脏器病原菌的分离鉴定及特异性基因的PCR检测。结果:（1）经生化鉴定及PCR鉴定分离得到9株Pm（命名为Pm8、Pm9、Pm12、Pm13、Pm14、Pm17、Pm18、Pm122,PmM6）,其中8株Pm的荚膜型:脂多糖型:MLST型均为A:L3:ST1型;另1株Pm的荚膜型:脂多糖型:MLST型为B:L2:ST44型。（2）9株Pm分离株的17个毒力基因（exbB,exbD,fimA,fur,hgbA,hsf2,nanB,ompH,ptfA,oma87,ompA,plpB,tonB,psl,sodA,sodC,tbpA）检出率高达100%,toxA的检出率为0%;9株Pm全部检出β-内酰胺类blaTEM基因,部分菌株检出strA,sul2,strB耐药基因;分离株均显示不同程度的致病性,4株毒力较强的菌株对小鼠LD50值分别为Pm8菌株为100.614.614 CFU,Pm12菌株为100.629 CFU,Pm13菌株为100.547 CFU,Pm122菌株为100.505CFU。（3）抗体水平检测结果:4株Pm菌苗在首次免疫小鼠后的第一周、第二周抗体水平缓慢上升,这两周抗体水平较低,抗体效价多为1:80,二免后的一周血清效价到达较高水平,效价为1:3201:640,其中Pm8,Pm12在二免后的一周血清抗体效价较高,达到1:640。免疫攻毒保护试验结果:在Pm攻毒后的14d菌苗对小鼠保护率分别为Pm12为80%,Pm122为56%,Pm8为66%,Pm13为40%;从免疫攻毒保护试验攻毒死亡小鼠肝脏中均分离出了相应的Pm。结论:从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A:L3:ST1型,并初步筛选出了1株毒力强且具有良好抗原性的菌苗候选株,为进一步研发Pm菌苗奠定了基础。