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目的脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)的病理过程包括原发性损伤和继发性损伤,炎症反应在SCI后继发性损伤中起着重要作用。研究发现,补体与炎症反应关系密切,补体活化后产生的C5a片段被认为是致炎作用最强的补体成分。SCI后,血脊髓屏障(Blood-spinal cord barrier,BSB)破坏,血液中的补体进入损伤处脊髓实质,侵入的补体及损伤局部合成的补体活化产生大量具有生物学活性的C5a,C3a等片段,因此推测C5a极有可能通过参与SCI后早期炎症反应而影响后期胶质瘢痕形成和脊髓功能的恢复。本实验首先利用雌性C57BL/6J小鼠建立脊髓损伤模型,采用补体裂解因子C5a受体拮抗剂(C5a receptor antagonist,C5aRA) AcF-[OP(D-Cha)WR(]PMX53)特异性拮抗C5a受体(complement 5a receptors,C5aR),达到阻断C5a发挥生物学效应的作用,同时设立甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)治疗组、生理盐水注射组以及假手术组对照,通过观察C5a对小鼠SCI后早期炎症因子TNF-α、IL-1β以及炎症细胞小胶质细胞/巨噬细胞变化、后期胶质瘢痕形成情况及行为学评分的影响,探讨C5a在小鼠脊髓损伤中的作用及机制。为了进一步证实其作用,随后采用C5aR-/-小鼠及C5aR+/+小鼠SCI模型进行了比较,观察C5a生物学效应彻底被阻断后能否减轻SCI小鼠脊髓的继发性损伤,促进功能恢复,并初步探讨其机制。方法:第一部分:利用成年雌性C57BL/6J小鼠建立脊髓夹伤模型,在损伤前45分钟经腹腔注入C5aRA,同时建立MP注射组、生理盐水注射组和假手术组对照。C5aRA组:在脊髓夹伤前45min经腹腔注入C5a受体拮抗剂AcF-[OP(D-Cha)WR](PMX53)(1.0mg/kg,上海吉尔生化有限公司合成),24h后再注射1次,共2次;MP注射组:脊髓夹伤后立即经腹腔注入MP(30mg/kg,辉瑞公司生产),后(30mg/kg/6h)4次,共5次;对照组:脊髓夹伤后经腹腔注入生理盐水(10ml/kg);假手术组:只打开椎板,不损伤脊膜及脊髓。检测观察各损伤组小鼠早期的炎症反应及后期胶质瘢痕形成情况和后肢功能恢复程度。以ELISA检测正常小鼠及各实验组小鼠损伤后1、12h、24、72h损伤处脊髓TNF-α、IL-1β表达量;RT-PCR检测正常小鼠及各实验组小鼠损伤后1、12、24、72h TNF-α、IL-1βmRNA水平表达;流式细胞术检测正常小鼠及各实验组小鼠损伤后1、3、7、14d小胶质细胞/巨噬细胞百分比含量; HE染色观察各组小鼠4w时脊髓的病理改变; GFAP免疫组织化学染色观察各组小鼠4w时脊髓星形胶质细胞反应情况;采用BMS后肢运动评分系统评估各损伤组小鼠夹伤后12h、2、7、14、28d后肢功能恢复程度。第二部分:采用BALB/c C5aR基因敲除小鼠(C5aR-/-)及野生型对照BALB/c小鼠(C5aR+/+)小鼠为实验动物建立小鼠脊髓夹伤模型,通过BMS评分系统评估后肢运动功能;流式细胞术检测2组SCI小鼠损伤后1、3、7、14d小胶质细胞/巨噬细胞百分比; HE染色观察2组小鼠SCI后4w时脊髓病理表现; GFAP免疫组织化学染色及Western Blot检测观察SCI后4w两组小鼠损伤处脊髓星形胶质细胞反应特点及程度。结果:第一部分:成功建立稳定的C57BL/6J小鼠脊髓夹伤动物模型,将T11节段脊髓夹伤致0.2mm,持续15秒;夹伤后整个脊膜完整,BMS评分0分判断为建模成功。设立C5aRA注射组、MP注射组、生理盐水注射组和假手术组4组。1.术后12h,各SCI小鼠BMS评分均为0分,假手术组未见后肢功能障碍。术后7d时,已出现C5aRA组小鼠后肢功能恢复高于生理盐水组,但弱于MP组小鼠,至28d,3组损伤小鼠间后肢功能恢复差异更明显,C5aRA组明显优于生理盐水组,仅略弱于MP注射组,各组间存在显著性差异。2.脊髓损伤后1h各损伤组炎症因子TNF-α、IL-1β均出现明显升高,TNF-α在1h即达峰值,IL-1β在12h达峰值,假手术组小鼠也出现轻微升高;各时间点MP注射组小鼠的TNF-α、IL-1β水平明显被抑制;C5aRA组小鼠TNF-α表达也较生理盐水组明显被抑制,但抑制程度较MP注射组为弱,IL-1β在仅在高峰期12h被抑制,其余时间点抑制不明显。3.生理盐水组小鼠脊髓损伤后TNF-α、IL-1βmRNA表达明显升高,增高趋势和蛋白水平相似,即TNF-α1h较高,IL-1β12h较高,72h降至基线水平,与生理盐水组相比,MP注射组小鼠的TNF-α、IL-1βmRNA表达水平明显被抑制,C5aRA组小鼠TNF-α被抑制,但抑制程度较MP注射组为弱,IL-1β在12h有抑制,其余时间点抑制不明显4.各SCI小鼠伤后第1天即出现小胶质细胞/巨噬细胞百分比升高,提示活化增殖,3d时较明显,7d达峰值,14d已下降,但仍高于正常。伤后各时间点假手术组仅出现轻微的增高,MP注射组小胶质细胞/巨噬细胞增殖较生理盐水对照组明显被抑制,C5aRA注射组小胶质细胞/巨噬细胞增殖也被抑制,但抑制作用在3、7d时间点时略弱于MP组。5.小鼠SCI后4w行HE染色提示,各SCI组小鼠损伤处脊髓结构破坏,中央管消失,大量嗜碱核细胞侵润,C5aRA组小鼠脊髓损伤处嗜碱核细胞浸润范围及数量明显少于生理盐水组,多于MP注射组,而假手术组小鼠脊髓结构正常,未见聚集成堆的嗜碱核细胞。6.小鼠损伤后4w,行GFAP的免疫组化染色观察胶质瘢痕的形成情况,可见各SCI组小鼠夹伤处正中形成形状不规则的空洞,空洞壁及周围大量GFAP阳性反应性星形胶质细胞量聚集,胞体增生、肥大,突起变粗变长,相互交织成网状,形成致密的胶质瘢痕,稍远处的星形胶质细胞形态基本接近正常。与生理盐水组比较,C5aRA组小鼠脊髓损伤处GFAP阳性反应性星形胶质细胞的数量较少,体积较小,但其反应仍强于MP组;假手术组未见形态肥大,突起增多的反应型星形胶质细胞及胶质瘢痕的形成。第二部分:1.两组SCI小鼠术后12h BMS评分均为0分,而在后续的观察时间点内,从损伤后1w开始,C5aR-/-小鼠的后肢运动功能恢复已表现出优于C5aR +/+组小鼠的趋势,并将此优势一直保持到伤后4w。SCI后4w时,C5aR-/-SCI小鼠后肢已出现频繁脚掌站立,但脚爪在触地和抬起时旋转,评分达5.00±0.61,而C5aR+/+SCI组小鼠后肢出现足底接触地面,偶尔脚背站立,但无脚掌站立,得分仅为3.20±0.76。两组间存在显著性差异。2.两组SCI小鼠伤后第1d小胶质细胞/巨噬细胞开始上升,7d较高,14d已下降,但仍高于正常。各时间点C5aR+/+组SCI小鼠小胶质细胞增殖明显较C5aR-/-组高。4、SCI后4w HE染色提示,C5aR-/-组小鼠脊髓损伤处嗜碱核细胞浸润数量和范围明显少于C5aR+/+组小鼠。5.免疫组化和Western blot检测均提示C5aR-/-组小鼠伤后4w GFAP的表达明显弱于C5aR+/+组小鼠。结论:1.补体C5a受体拮抗剂可提高小鼠脊髓损伤后BMS评分,于损伤早期抑制TNF-α、IL-1β表达,降低小胶质细胞/巨噬细胞增殖活性,于损伤后期减少胶质瘢痕形成;提示C5a可能在小鼠SCI后早期炎症反应及后期胶质瘢痕形成中起重要作用。2.通过应用C5aR-/-小鼠直接证实,C5a参与了脊髓损伤后早期炎症反应,促进了后期胶质瘢痕形成,对小鼠脊髓损伤修复产生不利影响。综上所述,本文利用小鼠脊髓夹伤模型,通过应用C5aRA与C5aR-/-小鼠,阻断活化的补体片段C5a发挥生物学效应后,观察到C5a参与了脊髓损伤后早期炎症反应,影响了SCI后期胶质瘢痕的形成,从而影响了后肢功能恢复。进一步加深了对脊髓损伤继发性损伤机制的认识。