论文部分内容阅读
非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的急性和高度接触性传染病。2018年8月在中国辽宁省沈阳市首次发现非洲猪瘟,对我国养猪业造成了巨大冲击。该病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,也是目前已知的唯一一种虫媒DNA病毒,其基因组约为170-193 kb,含有150-167个开放阅读框（Open reading frames,ORFs）,编码150-200种蛋白质,含有50种以上的结构蛋白。ASFV主要感染巨噬细胞,病毒基因组编码了多种蛋白可干扰宿主细胞的免疫反应,从而促进病毒复制与增殖。目前很多ASFV病毒蛋白的功能尚不清楚,研究病毒蛋白的功能对进一步了解病毒的致病机理,对新疫苗的研发具有一定的潜在意义。坏死性凋亡是近些年新发现的一种细胞死亡方式,该死亡方式依赖于RIPK1、RIPK3和MLKL,而细胞凋亡则依赖于Caspase。当死亡受体被激活时,RIPK1和RIPK3发生磷酸化修饰并形成复合物,作用于下游的MLKL,MLKL磷酸化修饰后发生寡聚化并从细胞质转移至细胞膜。MLKL寡聚体具有离子通道的功能,钙离子进入细胞后增加胞内渗透压,细胞膜受损,完整性丧失,最终导致细胞发生坏死性凋亡。病毒非结构蛋白A179L、A224L、DP71L和EP153R可在病毒感染初期抑制细胞凋亡,为病毒在细胞内复制增殖提供稳定的场所。病毒结构蛋白p54可在病毒感染后期促进细胞凋亡,为病毒扩散至其它健康细胞提供条件。细胞凋亡作为宿主细胞限制病毒复制的第一道防线,当细胞凋亡受到抑制时,坏死性凋亡就成为机体抵抗病原体入侵的第二道防线。坏死性凋亡会引起较强的炎症反应,进而激活机体的免疫系统对抗病原入侵。本论文将探究ASFV中是否存在可以调控细胞坏死性凋亡的蛋白。首先,我们对ASFV的基因序列进行分析,设计引物,通过PCR方法扩增ASFV结构蛋白与非结构蛋白的开放阅读框。扩增的片段克隆至真核细胞表达载体pcDNA-flag中,经PCR、质粒酶切、基因测序方法鉴定质粒的构建。最终,成功克隆了 12种ASFV结构蛋白与非结构蛋白。构建的载体转染后经Western Blot鉴定,发现ASFV的2种结构蛋白与3种非结构蛋白可在真核细胞中表达。为进一步探究ASFV编码蛋白对细胞坏死性凋亡的影响,我们用克隆的质粒转染小鼠成纤维细胞系L929细胞,用TNF-α、Smac和ZVAD（TSZ）诱导坏死性凋亡。Western Blot结果显示,A179L基因可促进TSZ诱导的RIPK1、RIPK3和MLKL磷酸化,同时诱导GAPDH释放至细胞培养上清中。Sytox Green染色的细胞流式术结果显示,A179L基因可促进TSZ诱导的坏死性凋亡。我们然后研究了 A179L对病毒诱导的细胞死亡的影响。我们首先应用单纯疱疹病毒（HSV-1）作为DNA病毒模拟ASFV在猪肠上皮细胞系IPEC-DQ上诱导的细胞凋亡与坏死性凋亡。Western Blot结果显示,A179L转染IPEC-DQ细胞后可抑制HSV-1诱导的Caspase-8和Caspase-3的切割,上调RIPK1和MLKL的磷酸化。Sytox Green染色与FITC Annexin V的细胞流式术结果显示,A179L基因可抑制单纯疱疹病毒诱导的细胞凋亡,促进其诱导的坏死性凋亡。我们进一步研究了 A179L是否亦影响仙台病毒（Sendai virus,SeV）（RNA病毒）感染诱导的细胞凋亡与坏死性凋亡。结果显示,A179L抑制SeV诱导的Caspase-8和Caspase-3 的切割,上调 RIPK1 和 MLKL 的磷酸化。Sytox Green 染色与FITC Annexin V的细胞流式术结果显示,A179L基因可抑制仙台病毒诱导的细胞凋亡,促进其诱导的坏死性凋亡。我们最后研究了 A179L是否亦影响H1N1流感病毒诱导的人支气管上皮细胞系NL20的细胞凋亡与坏死性凋亡。结果显示,A179L抑制流感病毒诱导的Caspase-8和 Caspase-3 的切割,上调 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 磷酸化。Sytox Green 染色与 FITC Annexin V的细胞流式术结果显示,A179L基因可抑制流感病毒诱导的细胞凋亡,促进其诱导的坏死性凋亡。这些结果表明,A179L可抑制DNA病毒与RNA病毒诱导的细胞凋亡,为病毒在细胞内复制增殖提供稳定的场所,同时促进TNF-α和病毒诱导的坏死性凋亡,促进机体炎症反应,造成组织病理损伤。