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目的通过对ExoQuick-TC试剂盒进行改良,探索高产量、少杂质的外泌体提取方法。通过将肝癌细胞外泌体(exosomes,EXO)与DC共培养,观察EXO对DC表面成熟相关分子表达、细胞因子分泌及刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的影响。并通过改良癌痛消方(improved Aitongxiao prescription,I-ATXP)干预肝癌细胞,观察干预后的肝癌细胞释放的外泌体(ATX-EXO)对DC以上表型和功能的影响,以及肝癌细胞释放的外泌体量是否改变,了解I-ATXP是否可以通过肝癌外泌体途径调节DC相关免疫功能。方法(1)ExoQuick试剂盒改良法提取外泌体:HepG2细胞用无外泌体血清培养基培养24 h后,收集上清,过0.22μm滤膜、10000×g,30 min离心去除密度、体积比外泌体大的细胞碎片等杂质,再用10 kb超滤管滤去小分子物质并浓缩样本体积,最后按ExoQuick-TC试剂盒说明书步骤提取外泌体。(2)外泌体的鉴定:Western Blot检测外泌体标记蛋白CD63、ALIX和细胞成分蛋白cytochrome C的表达,透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察外泌体形态结构和大小,Nano FCM分析外泌体粒径分布及颗粒浓度。(3)不成熟DC(imDC)的诱导培养:取健康人新鲜抗凝血,Ficoll密度梯度离心法获取PBMCs,用免疫磁珠法分选得到CD14~+细胞,加细胞因子GM-CSF 20 ng/mL、IL-4 10 ng/mL、IFN-β10~5 U/mL培养24 h,诱导CD14~+细胞分化为imDC。(4)外泌体干预imDC方法:用50、100、200(μg/mL)的HepG2细胞外泌体与imDC共培养,同时加入10 ng/mL LPS刺激imDC成熟,培养72 h,分别收集细胞和培养上清,用流式细胞仪检测DC成熟相关表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达,ELISA检测培养上清中细胞因子IL-12的水平,CCK-8法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。(5)I-ATXP干预HepG2方法:用0.125、0.25、0.5、1.0(mg/mL)的I-ATXP干预HepG2细胞24 h提取外泌体,考马斯亮蓝法(Bradford法)和乙酰胆碱酯酶发光试验(AchE法)检测外泌体的量,并用CCK-8法检测以上4种浓度的I-ATXP对HepG2的细胞毒性作用,以确定外泌体量的改变是否由于细胞数量差异所致。(6)ATX-EXO干预imDC:选用对细胞存活率无影响的最大I-ATXP剂量(0.5 mg/mL)干预HepG2细胞,提取ATX-EXO按方法(4)对imDC进行干预,比较DC的相同指标。结果(1)Western-Blot检测显示用ExoQuick-TC试剂盒改良法提取的外泌体样本CD63、ALIX相对表达量高于单纯试剂盒法,且不表达细胞成分蛋白cytochrome C,说明提取的样本中不含细胞成分;透射电镜显示改良法提取的外泌体样本清晰可见类圆形囊泡,直径在30-100nm之间,符合外泌体的特征,且杂质较单纯试剂盒法少;Nano FCM检测改良法所得HepG2外泌体样本平均粒径为75.81±26.47(mean±s.d.,nm),与透射电镜结果一致,另外检测改良法提取的其他4种癌或非癌肝细胞外泌体样本,显示粒径分布相似,说明此方法较稳定。(2)流式细胞术检测显示与肝癌细胞外泌体(EXO)共培养的DC表达CD80、CD83的细胞比例较仅加入LPS的对照组降低,CD86、HLA-DR表达较对照组无明显差异;ELISA显示200μg/mL EXO干预的DC较对照组分泌IL-12减少;CCK-8检测显示200μg/mL EXO干预的DC较对照组刺激异体淋巴细胞增殖的能力降低。(3)HepG2接板浓度为5×10~5个/mL时,Bradford法和AchE法检测显示0.5和1.0 mg/mL的I-ATXP干预HepG2分泌外泌体的量较不加药的对照组减少;而CCK-8细胞毒性实验检测显示,0.125、0.25、0.5 mg/mL的I-ATXP浓度对HepG2 24h存活率无明显影响,1.0 mg/mL的I-ATXP浓度降低了HepG2存活率。提示0.5 mg/mL的I-ATXP可以在不减少细胞量的情况下减少HepG2外泌体产生。(4)与EXO干预组对比,ATX-EXO干预的DC表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达、IL-12的分泌、刺激异体T细胞增殖的能力均无明显变化。结论ExoQuick-TC试剂盒改良法可以从细胞培养上清提取到较高产量和较少杂质的外泌体,HepG2外泌体对DC的表面分子表达、细胞因子的分泌、刺激异体淋巴细胞增殖的能力均有一定的抑制作用,I-ATXP在不影响HepG2存活率的情况下可以减少其分泌外泌体的量,但是I-ATXP没有改变HepG2外泌体对DC的抑制活性,即可能没有引起外泌体质的改变。