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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)均为冠状病毒科(Coronviridae)冠状病毒属(Coronavirus)成员,是引起猪腹泻的重要病原。近年来,国内外对PEDV和TGEV全序列的测定、基因工程疫苗的研究及反向遗传学的研究做了大量工作。本研究以采集的甘肃PEDV DX和TGEV TS毒株为材料,进行了两毒株全基因组的测序、部分基因的表达、真核表达载体的构建和缺陷性病毒载体的构建。其主要结果如下:1.克隆了猪流行性腹泻病毒DX株结构蛋白基因和非结构蛋白基因。分析结果显示DX株S基因、M基因、sM基因和N基因分别为4152、681、231和1326个碱基,聚合酶基因和ORF3基因分别为20354和675个碱基。结构蛋白S基因核苷酸数与英国毒株CV777、中国株JS-2004-2以及韩国株Chujin99相等,均为4152个碱基,比韩国毒株AF500215、AF237764 S基因少9个碱基。同源性分析显示其与中国毒株JS-2004-2关系最为密切。2.构建猪流行性腹泻病毒DX毒株N蛋白基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达出了预期的N蛋白,试验表明其有良好的反应原性。3.分别构建了PEDV和TGEV S和N双基因腺病毒表达载体,转染细胞显示绿色荧光蛋白得以表达,证明目的外源基因可在细胞中表达。4.克隆了猪传染性胃肠炎病毒TS株全基因组。结果表明TGEV TS株全长基因组为28541 bp。其中结构蛋白基因S、sM、M和N分别为4350、246、786和1146碱基,非结构蛋白基因ORF1、ORF3和ORF7分别为20054、1015和237碱基, 5’和3’非编码区分别为319和280碱基。TGEV TS ORF1a和ORF1b蛋白分别由4017和2680个氨基酸组成。进化树分析表明所有TGEV毒株可分为Purdue和Miller亚群,TGEV TS株与Miller亚群进化关系最为相近。5. TGEV TS株在ST、IB-RS-2(IB)和PK-15细胞上传代表明:在该3种细胞连传10代均可出现病变,ST细胞接毒后培养36小时病变特征明显,IB-RS-2和PK-15细胞接毒后48小时病变明显。TGEV TS株在ST细胞接毒后连传10代培养可以用PCR方法检测到3’端基因组,而其在IB和PK-15上接毒后连传10代用PCR方法检测不到3’端基因组。TGEV TS株在PK-15和IB细胞接毒连传50培养,感染PK-15细胞可检测到3’端基因组,而感染IB细胞检测不到3’端基因组。TS株接毒ST和PK-15细胞连传50代培养,PCR扩增3’端基因组发现TS毒株在PK-15细胞传代变异比ST细胞变异大。6.构建TGEV TS缺陷性病毒载体M33,并将绿色荧光蛋白基因插入到载体中,在辅助病毒的作用下转染ST细胞,可观察到荧光蛋白的表达。