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目的：1.检测人Aiolos蛋白在四种白血病细胞系及正常儿童外周血淋巴细胞中的表达。2.构建人Aiolos基因和绿色荧光蛋白融合基因的重组慢病毒载体,将其转染急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞并检测慢病毒载体转染效率。3.探讨Aiolos基因过表达对Jurkat细胞的细胞周期、凋亡及对化疗药依托泊苷化疗敏感性的影响。4.通过检测相关基因的表达解释Aiolos基因过表达对Jurkat细胞的细胞周期、凋亡及化疗敏感性产生影响的可能机制。方法：1.收集各白血病细胞系对数生长期生长良好的细胞和正常儿童的外周血淋巴细胞,用western blot法进行Aiolos蛋白表达水平的检测。2.构建Aiolos基因和绿色荧光蛋白融合基因的重组慢病毒载体并转染Jurkat细胞。首先从Jurkat细胞系中提取RNA并反转录得到cDNA,以cDNA为模板,利用高保真酶PCR获取Aiolos全长基因,EcoRI与Mlul双酶切后连接到PWPURO载体、转化,PCR法筛选阳性克隆,提取质粒,酶切测序。然后将病毒穿梭质粒及包装原件载体质粒共转染293T细胞,得到含Aiolos基因的慢病毒过表达载体PWPURO-Aiolos。采用逐孔稀释滴度测定法进行病毒滴度测定。将载体以不同MOI值感染293T细胞,4天后通过荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,明确慢病毒是否成功感染293T细胞,并确定最佳MOI值。3.将构建完成的慢病毒过表达载体PWPURO-Aiolos转染Jurkat细胞,感染复数为MOI=100。将细胞分3组：Aiolos过表达组(转染含PWPURO-Aiolos的慢病毒载体),即上调Jurkat细胞中Aiolos的表达；转染GFP组,即转染仅含GFP的慢病毒载体；未转染组,不做转染处理。转染后第4天通过荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,并用western blot法检测Aiolos蛋白表达水平。慢病毒载体感染细胞7天后收集细胞,按照Muse检测细胞周期及凋亡试剂盒说明书要求的细胞数目及密度,检测细胞周期和凋亡。CCK-8法检测化疗药物依托泊苷对3组细胞杀伤作用。qRT-PCR法检测细胞周期、细胞凋亡等相关基因的表达。结果：1.Aiolos蛋白在Jurkat、 K562、 Molt-4和Nalm-6四个细胞系及正常儿童外周血淋巴细胞中均有表达,在Jurkat细胞系(急性T淋巴细胞白血病)中表达较高,在Nalm-6(急性B系淋巴细胞白血病)、Molt-4(急性T淋巴细胞白血病)表达较低,在K562(慢性粒细胞白血病)表达最低(图1)。但相对于正常人外周血淋巴细胞,各细胞系中Aiolos的表达均较低(P<0.05)。2.成功构建人Aiolos基因过表达慢病毒载体PWPUROS-Aiolos,病毒滴度为3.11x108TU/ml。经预实验验证感染复数MOI值=100是最适的MOI值。人Aiolos基因过表达慢病毒载体高效转染人急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞,转染后4-7天荧光显微镜下可观察到含绿色荧光蛋白的细胞比率达80%以上,且Aiolos过表达组的Aiolos蛋白表达较转染GFP组和未转染组明显上升(P<0.05)。转染GFP组和未转染组相比Aiolos蛋白表达无显著差异(P<0.05)。3.细胞周期检测结果显示：Aiolos过表达组Jurkat细胞相对于转染GFP组及未转染组细胞,由G0/G1进入S期比例明显减少(P<0.05),表明Aiolos基因过表达可抑制细胞周期,而转染GFP组和未转染组比较无显著差异(P<0.05)。4.细胞凋亡检测结果显示：Aiolos过表达组细胞凋亡比例较转染GFP组和未转染组明显增加(P<0.05),其中早期凋亡比例及晚期凋亡比例均增加(P<0.05),表明Aiolos过表达可促进细胞凋亡,而转染GFP组和未转染组相比较无显著差异(P>0.05)。5.相关基因的检测结果显示：周期相关基因Cyclin D3和细胞周期典型负性调节因子Skp2表达下调(p<0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21和P27表达上调(P<0.05)；凋亡抑制基因Bcl-2表达下调(P<0.05),凋亡促进基因Bax表达无明显变化,但Bax/Bcl-2比例增加(P<0.05)。6.对依托泊苷化疗敏感性结果显示：不同时间在3组Jurkat组细胞中加入不同浓度依托泊苷,依托泊苷对细胞的杀伤能力呈浓度和时间依赖性,Aiolos过表达组细胞在依托泊苷浓度40μg/mL作用36、48h后,细胞存活百分率较转染GFP组及未转染组均明显降低(P<0.05)。结论：成功构建Aiolos过表达慢病毒载体PWPURO-Aiolos,并成功转染白血病细胞系Jurkat细胞。Aiolos基因过表达能够抑制细胞周期,促进细胞凋亡,并增强Jurakt细胞对化疗药物依托泊苷的敏感性。