鞭毛是很多细菌具有的运动器官。自然界中的细菌，利用鞭毛的推动，运动到营养物质更丰富、更有力于其生存的环境中。有些致病菌的鞭毛还与其致病性密切相关。例如，在致病菌侵染人体初期，鞭毛功能正常的细菌能较快吸附到人体细胞上，依靠鞭毛的推动突破人体表皮粘膜的防护。而失去鞭毛的菌株将失去吸附能力，从而丧失其致病性。因此，细菌鞭毛的合成途径是设计新型抗菌药物的重要的靶点之一。　　 细菌的鞭毛实际上是一个大的蛋白质复合体，鞭毛蛋白的合成和组装由一系列的蛋白共同参与来完成。鞭毛基因的转录和翻译都有着严格的时序性。大肠杆菌基因组中有超过25个操纵子、近60个基因直接参与鞭毛的合成过程。根据基因的转录顺序的不同，这些基因被分为三类:第一级鞭毛基因，第二级鞭毛基因和第三级鞭毛基因。处于整个流程最上游的、最先被转录和表达的是flhDC操纵子。此操纵子中包含flhD和flhC两个基因。这两个基因的表达产物组装成异源蛋白质六聚体FlhD4C2。FlhD4C2复合物能够结合在第二级鞭毛基因上游的启动子位置，是启动这些基因的转录所必需的。第二级鞭毛基因包含编码组成基体和钩型鞘的蛋白质、鞭毛特异的三型分泌系统的组分蛋白及鞭毛特异的转录因子δ28的基因。第三级鞭毛基因的表达产物包括鞭毛组装蛋白、调控鞭毛功能的蛋白以及一些未知功能的蛋白。鞭毛基因这种分层调控的特征在革兰氏阴性细菌中是高度保守的。　　 鞭毛蛋白的表达和鞭毛的合成过程是高度有序的过程，鞭毛的调控也会受到很多因子的在不同层次的调控。对于flhDC操纵子的调控是最关键的调控点，多种调控因子分别在DNA，mRNA以及蛋白水平上对于此操纵子进行调控。本文的研究对象YdiV是最近被识别的、在蛋白水平上调控FlhDC功能的蛋白。　　 YdiV属于负责降解C-di-GMP的EAL蛋白家族中的一员。但YdiV序列中负责催化C-di-GMP降解所必需的10个保守的氨基酸中8个发生了突变。也就是说YdiV可能不具有降解C-di-GMP的功能。早期的研究发现这个蛋白功能与EAL的同源蛋白有很大不同:正常EAL结构域的蛋白正调控细菌的移动性，而YdiV蛋白显著抑制细菌的鞭毛合成和移动性;YdiV蛋白对细胞内C-di-GMP浓度的影响也存在着争议。2011年，Wada等将沙门式菌中YdiV蛋白的作用对象锁定在FlhDC复合物上，但这一过程中的具体机制仍然不明确。另外，2012年Takaya等人研究发现YdiV协助ClpXP蛋白酶降解FlhDC复合物，而本身不被降解。这一过程的机制也未知。本论文研究试图通过结构生物学、生物化学、分子生物学及微生物学的多种实验方法结合来揭示YdiV抑制细菌移动性这一过程的分子机制。　　 本论文的主要研究内容和结论如下:　　 (1)使用蛋白质晶体X射线衍射法解析得到了1.9(A)分辨率的大肠杆菌YdiV蛋白结构。将YdiV结构与其他EAL结构进行对比发现两者在折叠类型上较相似，但是结构细节有较大的差别。与其他EAL蛋白不同，YdiV在溶液中以单体形式存在。虽然YdiV不能结合C-di-GMP，但保守的C-di-GMP结合凹槽仍然存在。YdiV的结构中，此凹槽中结合了一个甘油分子和一个磷酸分子。这说明YdiV虽不能结合C-di-GMP，但其可能结合某些比C-di-GMP小的、构象类似的小分子，由此来调控其下游的功能。　　 (2)首次验证了大肠杆菌YdiV蛋白的FlhDC的相互作用。并将YdiV相互作用的对象锁定在FlhD上。为了找到与YdiV相互作用的最小FlhD片段，克隆了四个FlhD片段-FlhD1-71aa，FlhD1-82aa，FlhD1-98aa，FlhD1-106aa。将于YdiV相互作用的区域确定为FlhD的N端71个氨基酸。EMSA实验发现Ydiv抑制FlhDC结合DNA呈现浓度效应:当YdiV的浓度比较低时，YdiV与FlhDC形成的复合物还能结合DNA，但当YdiV与FlhDC的比例超过3以后，形成的复合物就不能结合DNA。　　 (3)使用蛋白质晶体X射线衍射法解析得到了2.9(A)分辨率的YdiV-FlhD复合物的结构。结构分析结合生化实验证明，在溶液状态下复合物以YdiV2-FlhD2四聚体的形式存在。YdiV的第6、7、8个α螺旋与FlhD的第1、4个α螺旋组成两蛋白的相互作用面。复合物结构中YdiV、FlhD与各自的单体结构的构象变化都不大，但参与相互作用的具体氨基酸有比较大的构象变化。通过序列比对发现，参与YdiV与FlhD相互作用的氨基酸在所有肠道细菌中都非常保守，暗示其他肠道细菌中YdiV同源蛋白通过相同的机制发挥功能。　　 (4)通过对FlhD4C2复合物的结构分析，找到了位于蛋白质表面可能与DNA结合有关的正电荷密集的区域。并通过定点突变的方法，克隆并纯化得了多种FlhD4C2的突变体。EMSA实验证明突变体蛋白都完全丧失了DNA结合的活性。这一数据有力的证明，FlhC上正电荷富集的区域和环状结构都是FlhD4C2结合DNA所必须的。DNA主要结合在FlhC亚基上，而FlhD亚基对于形成和稳定FlhD4C2环状结构和DNA结合都是必不可少的。最后，提出了FlhD4C2复合物与DNA相互作用的模型:DNA与FlhC上正电荷富集的区域互作，并被FlhC上的锌指结构固定。整体构象上，DNA呈现一定的弯曲度，并且DNA是环绕FlhC亚基的。　　 (5)通过YdiV-FlhD结构与FlhD4C2结构的叠合，模拟出了YdiV1-FlhD4C2，YdiV2-FlhD4C2.YdiV3-FlhD4C2和YdiV4-FlhD4C2四种三元复合物的结构模型。使用负染电镜的方法观察到了不同构象的YdiV-FlhDC三元复合物，验证了我们提出的三元复合物结构模型。　　 (6)构建了多种YdiV突变体来进一步验证突变体功能。发现不能与FlhD互作的YdiV突变体也都不能抑制FlhD4C2的DNA结合活性，并且不影响细菌的移动性。说明YdiV蛋白影响细菌移动性的原因确实是由其与FlhD相互作用而引发的。另外，我们分析YdiV-FihD结构，设计了沙门式菌同源蛋白CdgR的一些突变体。使用Pulldown方法检测了这些突变体与stFlhD和stFlhDC的相互作用。实验数据暗示沙门氏菌CdgR蛋白与YdiV蛋白的作用机制是类似的。　　 (7)对YdiV蛋白与ClpX蛋白相互作用情况进行了初步的研究。YdiV与ClpX的ZBD结构域在体内共转共纯化时存在相互作用，而当分别提纯得到两种蛋白在体外却检测不到蛋白间的相互作用。提出细胞内某小分子（与C-di-GMP有类似的结构）可能结合到YdiV的疏水口袋调控YdiV与CipX的相互作用的假说。　　 根据以上实验结果，提出了YdiV负调控细菌鞭毛合成和移动性的分子机制模型:溶液中的YdiV蛋白以单体形式存在。YdiV蛋白主要通过第8个α螺旋与FlhD分子上第1和第4个α螺旋相互作用。在FlhD4C2复合物中，四个FlhD分子(D1，D2，D3，D4)所处的状态不同。D1-D2和D3-D4各自组成二聚体。而D2和D3分子的相互作用面也是由其第1和第4个α螺旋介导的。由于D1和D4分子的第1和第4个α螺旋是暴露的，所以当YdiV分子处于较低的浓度时，YdiV分子优先结合在这两个FlhD分子上。DNA结合在FlhD4C2复合物的FlhC亚基外侧上，几乎不与FlhD接触。所以YdiV结合在D1和D4上时候，形成的YdiV1FlhD4C2和YdiV2FlhD4C2三元复合物还能和DNA结合，这时FlhDC的转录因子活性并没有受到抑制。当YdiV浓度升高到一定程度，当所有的D1和D4亚基都被饱和的时候，YdiV就开始吸附D2或D3分子。这时由于YdiV的侵入，FlhD4C2六元环状结构被迫打开。目的DNA与FlhD4C2结合是一个精确的定位过程，DNA结合到FlhD4C2分子上时呈现一定的弧度，FlhD4C2的圆环状构象对于其结合DNA的能力也是必不可少的。多个YdiV结合导致FlhD4C2六元环状结构被破坏，DNA将不能结合到此复合物上。这时FlhD4C2转录辅助因子的功能丧失，第二级及之后的鞭毛蛋白停止表达。最终导致鞭毛合成受阻，细菌的移动性减弱甚至消失。FlhD4C2复合物结合过量YdiV后环状结构打开，结构变的疏松。YdiV蛋白通过与细胞内ClpXP蛋白酶的ClpX亚基的ZBD结构域互作，促进其结合的FlhD4C2复合物被ClpXP蛋白酶降解掉。YdiV调控鞭毛表达和细菌移动性的过程是浓度依赖的并且是不可逆的。　　 细胞内YdiV的浓度受到很多因素的影响。已有文献报道，外界葡萄糖的浓度显著影响细胞内YdiV蛋白的浓度。另外，ydiV基因转录活性受转录调控因子SdiA蛋白的调节，而SdiA蛋白与DNA的结合活力又受细菌产生的自诱导物的直接影响。即细菌所处环境的菌浓的不同，细胞内的YdiV的浓度也会不同。我们的研究发现只有在YdiV浓度足够高时，细菌的鞭毛合成才会完全停止。细菌的鞭毛表达是个十分耗时和耗能的过程，细菌鞭毛合成与否是细菌生命状态的一个重大决定。只有当外界信号分子的浓度足够大并且持续时间足够长时，细胞内的YdiV的表达量才会积累到足够的浓度，这时细菌的鞭毛合成才被迫从源头终止。YdiV蛋白作为EAL蛋白家族的一员，其发挥的功能与正常EAL蛋白南辕北辙。这一现象给我们启示，细菌基因组中大量突变失活的酶可能是通过其他途径发挥重要功能的。