【摘 要】
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小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是豆科棘豆属（Oxytropis）的有毒植物。本课题组前期分离出小花棘豆内生真菌Alternaria oxytropis,可产生有毒吲哚兹啶类生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,SW导致动物细胞空泡变性和代谢功能紊乱,牲畜过量采食含SW的小花棘豆出现中毒现象,严重则导致死亡,从而危害了草原畜牧业发展。目前对A.oxytropis中
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“基于转录组学的小花棘豆内生真菌苦马豆素合成相关基因的筛选和功能研究”（项目编号:31960130）和“小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因在苦马豆素代谢中的作用”（项目编号:31460235）；
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小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是豆科棘豆属（Oxytropis）的有毒植物。本课题组前期分离出小花棘豆内生真菌Alternaria oxytropis,可产生有毒吲哚兹啶类生物碱——苦马豆素（swainsonine,SW）,SW导致动物细胞空泡变性和代谢功能紊乱,牲畜过量采食含SW的小花棘豆出现中毒现象,严重则导致死亡,从而危害了草原畜牧业发展。目前对A.oxytropis中SW合成的分子机制及代谢途径研究甚少,对其进行研究有重要的意义。本课题组前期发现酵母氨酸还原酶（saccharopine reductase,Sac）在A.oxytropis OW7.8的SW合成中起重要作用,其他参与SW合成各步反应的关键酶基因还未深入研究。在部分产SW的绿僵菌中,推测swnH1基因编码的2-酮戊二酸铁依赖性双加氧酶催化（1S,2S/R,8a S）1,2-二羟基吲哚里西啶生成SW。本研究首次在A.oxytropis OW7.8中克隆了swnH1基因及cDNA（Gen Bank accession number:ON416998）,对其进行生物信息学分析。构建基因的敲除载体、过表达载体及基因编辑载体,将其转化A.oxytropis OW7.8原生质体,经再生培养筛选转化子,利用PCR及DNA测序进行验证。分析在A.oxytropis OW7.8中swnH1基因对SW合成的影响,为探索该真菌SW合成的分子机制及代谢途径提供基础数据。主要研究结果如下:1.根据A.oxytropis OW7.8基因组测序数据设计引物,利用PCR技术克隆了swnH1及cDNA序列,该基因的ORF为921 bp,预测编码306个氨基酸。基因序列起始密码子ATG至终止密码子TAG,全长987 bp,其中包含一个66 bp的内含子,内含子边界序列符合GT-AG法则。对SwnH1氨基酸序列进行生物信息学预测,其分子量为36377.78 Da,等电点为6.61,分子式为C1624H2568N444O476S14,编码亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,大概率定位于细胞质中。2.将A.oxytropis OW7.8接种至含不同浓度Hyg B（0.4μg/m L、0.5μg/m L、0.6μg/m L、0.7μg/m L、0.8μg/m L、0.9μg/m L、1μg/m L、2μg/m L、3μg/m L、4μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、15μg/m L、20μg/m L）的PDA培养基上,发现当Hyg B浓度≥1μg/m L时,可完全抑制其生长,可依此筛选转化子。3.利用PCR技术扩增swnH1的上游同源臂（618 bp）、潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase,hph）的5’端（764 bp）、hph 3’端（931 bp）和下游同源臂（322 bp）序列。采用Split-marker方法连接成swnH1基因敲除片段,并将其与p MDTM19-T载体连接,构建出swnH1的敲除载体（5008 bp）。4.扩增两端带Eco RⅠ和Bam HⅠ限制性酶切位点的swnH1的cDNA序列,用上述两种限制性酶对p BARGPE1-Hygro载体进行双酶切后,将两者连接,以Pgpd A为启动子,Ttrp C为终止子,构建出swnH1的过表达载体（7087 bp）,将其转化OW7.8原生质体,筛选到一个过表达转化子swnH1-T1（Hyg B 2μg/m L）,相比于野生型OW7.8其菌落形态有所不同,菌落为黑色呈松散的片状,生长速度缓慢。5.利用重叠PCR技术扩增swnH1基因的sg RNA表达盒,通过无缝克隆与p FC332载体进行连接,构建出swnH1基因的CRISPR-Cas9基因编辑载体（16510 bp）,载体包含g RNA scaffold、Ampr、hph,启动子Pgpd A和终止子Ttrp C等元件。
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