背景:传统的清创、换药、负压吸引术等方法对慢性创面有一定的治疗作用,但对于患者基础情况差、病程超过3个月的慢性难愈性创面常达不到令人满意的效果。富血小板血浆(Platelet Rich Plasma,PRP)是血液离心后制备的血小板浓缩物,PRP激活后可以释放多种生长因子(如PDGF,VEGF,EGF,FGF等),刺激细胞生长分化、血管生成,促使创面愈合。慢性难愈性创面需多次应用PRP治疗,而新鲜PRP制备既增加患者痛苦,又消耗医务人员精力和时间,因此探讨PRP不使用任何冻存剂情况下的适宜贮存温度及贮存时间,分析贮存PRP对慢性难愈性创面的治疗作用,为PRP临床应用提供更便捷的应用方式。目的:(1)制备有效浓度的PRP,通过分析不同贮存条件下PRP中生长因子变化,及PRP对细胞增殖及迁移作用的影响,以探寻PRP贮存的最适宜条件;(2)分析PRP对传统治疗无效的慢性难愈性创面患者的治疗效果;(3)比较贮存PRP与新鲜PRP对慢性难愈性创面的治疗效果。方法:(1)抽取健康志愿者外周血,二次离心法制备PRP,计算血小板富集倍数及血小板回收率;(2)ELISA方法检测贮存于4℃,-20℃和-80℃条件下0天、7天、14天和28天的PRP中血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)含量;(3)MTS法分析0.5%、1%、5%浓度新鲜PRP及4℃、-20℃和-80℃条件下贮存PRP对人真皮成纤维细胞增殖与迁移的影响;(4)选择病程超过3个月的慢性难愈性创面患者,应用个体化序贯综合治疗,筛选出治疗无效的慢性难愈性创面患者,进一步给予每周一次的新鲜或贮存PRP治疗。(5)分析PRP治疗7天、14天、21天及28天,慢性难愈合性创面面积、创面面积缩小率变化;治疗前后创面床改善率,创面完全愈合时间、VAS疼痛评分及PRP治疗相关的不良反应。(6)分析比较应用新鲜自或贮存PRP治疗慢性难愈性创面28天,慢性难愈性创面的创面面积缩小率、创面床改善率的变化。结果:(1)应用二次离心法制备的PRP平均血小板富集倍数为4.85±0.22倍,血小板回收率为72.06±10.21%。(2)贮存7天,各温度贮存PRP中生长因子均无明显下降;贮存14天,4℃贮存PRP中PDGF及VEGF含量较新鲜PRP相比均明显下降(p<0.01),4℃贮存PRP中VEGF含量较-20℃、-80℃贮存PRP相比均明显降低(P<0.05);贮存28天,4℃贮存PRP中四种生长因子含量较新鲜PRP、-20℃及-80℃贮存PRP相比均明显下降(p<0.01);贮存14天、28天,-20℃贮存PRP较-80℃贮存PRP相比,四种生长因子均无明显下降(p>0.05)。(3)1%、5%新鲜(0天)PRP的细胞增殖作用显著高于10%FBS(p<0.05)。PRP贮存于-20℃和-80℃7天、14天及28天,对成纤维细胞增殖作用均明显优于对应时间的4℃贮存PRP及10%FBS(p<0.05),但-20℃贮存和-80℃贮存PRP对成纤维细胞增殖作用无明显差异(p>0.05)。(4)-20℃贮存或-80℃贮存14天及28天的PRP培养细胞12h,细胞迁移率均较4℃贮存PRP及10%FBS组细胞迁移率明显增大(均p<0.01),但-20℃贮存和-80℃贮存PRP细胞迁移率无明显差异(p>0.05)。(5)临床研究纳入67例患者,共74处慢性创面。经过个体化序贯综合治疗,筛选出19例患者,共22处治疗效果不佳的慢性难愈性创面,给予PRP治疗,其中13处创面应用新鲜PRP治疗,9处创面应用-20℃贮存PRP治疗。(6)PRP治疗28天,创面面积缩小率≥50%的慢性难愈性创面为81.82%,创面床改善率≥50%的慢性难愈性创面为90.91%;PRP治疗后28天,慢性难愈性创面面积较PRP治疗前显著缩小(p<0.01);VAS评分由治疗前6.68±1.32减小至1.86±1.67(p<0.01),治疗期间未发生与PRP治疗相关的不良事件。(7)应用-20℃贮存PRP治疗28天与新鲜PRP治疗28天比较,慢性难愈性创面患者的创面缩小率及创面床改善率均无明显差异(p>0.05)结论:(1)PRP在-20℃及-80℃条件下贮存4周,仍具有相应的生物活性,-20℃及-80℃贮存效果无差异;(2)PRP对经个体化序贯综合治疗无效的慢性难愈性创面具有良好治疗作用;(3)新鲜或贮存PRP均可有效治疗慢性难愈性创面,PRP的有效贮存应用,拓展了PRP的应用方式,为治疗难治性创面提供了新的思路及手段。