论文部分内容阅读
目的: 采用神经干细胞基因芯片和microRNA基因芯片,观测、分析艾灸对快速老化小鼠SAMP8海马神经发生基因和microRNA基因表达的影响;以差异神经发生基因和microRNA为节点、其相互关系为边,构建分子调控网络,从分子网络调控角度探讨、阐释艾灸对快速老化小鼠SAMP8海马神经发生的作用机制,为进一步深入研究奠定基础。 方法: 以SAMP8小鼠作为衰老模型,随机分为模型组和艾灸组,以SAMR1小鼠作为正常对照组(正常组)。艾灸组选用“百会”穴进行治疗。行麦粒灸,每天治疗一次,7天为1疗程,疗程期间休息2天,连续治疗3个疗程。治疗结束后,取海马组织。 1.提取总RNA,并使用紫外分光光度计和变性凝胶电泳行RNA质量检测后,合成cDNA,采用Oligo GEArray神经干细胞基因芯片杂交,检测分析芯片结果。取RATIO值大于2为上调,小于0.5为下调,筛选出艾灸干预后小鼠海马神经发生的差异基因。同时采用实时定量PCR技术验证基因芯片结果,以确保芯片结果的可靠性; 2.提取总RNA,分别用紫外分光光度计及变化凝胶电泳对RNA质量进行检测,质量合格后,分离、标记microRNA,采用Exiqo MiRCURYTM LNA microRNA芯片杂交,扫描、分析图像,取Fold Change值大于2为上调,小于0.5为下调,筛选出艾灸干预后小鼠海马中的差异microRNA; 3.整理干细胞基因芯片和microRNA芯片筛选差异基因和microRNA,根据基因表达的相关性,按照正常-疾病模型-治疗的逻辑顺序构建随着样本的不同时期变化的基因共表达网络,找出差异基因;同时根据差异microRNA在miRDB数据库中找其靶基因,然后分析出microRNA和交集靶基因的关系属性,利用microRNA与靶基因之间的靶向关系构建 microRNA-Gene调控网络,最终得到网络调控中起核心作用的miRNA和被 miRNA调控的关键靶基因,最终明确艾灸促进海马神经发生的主要miRNA和基因。 结果: 1. RNA质量检测结果显示,各组RNA样品OD260/280比值都在1.8-2.1之间,全部符合实验要求。 2.各组小鼠海马组织神经干细胞基因芯片检测结果显示,模型组与正常组比较,11条基因表达上调,分别为Atoh1、bai2、Bcl2l1、BMP7、Dcx、Efnb1、Gas7、Mtap1b、Notch2、Otx2、Rapgef5,仅有1条Klk6基因下调;艾灸组与模型组比较,7条基因表达上调,分别为 Apaf1、Dclk1、Efnb1、Epm2a、Gli3、Nrxn3、Reln,无基因表达下调;艾灸组与正常组比较,6条基因表达上调,分别为Atoh1、BMP7、Gas7、Notch2、Ntf3、Pard6b、Rapgef5,3条基因表达下调,分别为Fos、Klk6、Reln。 3.荧光定量RT-PCR实验显示,各基因扩增曲线平滑,均有明显的指数扩增期,提示 PCR检测具有较好的敏感性;各基因溶解曲线均为单一峰,未出现其它异常波形,提示PCR扩增特异性较好;相对定量法进行数据分析表明基因表达的变化与芯片结果一致,芯片结果可靠。 4.各组小鼠海马组织microRNA基因芯片检测结果显示,模型组与正常组比较,3条基因表达上调,45条基因表达下调;艾灸组与模型组比较,10条基因表达上调,1条基因表达下调;艾灸组与正常组比较,14条基因下调。其中 miRNA基因mmu-miR-715,mmu-miR-712*,mmu-miR-879*,mmu-miR-M1-2,mmu-miR-10b, mmu-miR-367在模型组下调,但在艾灸组表达上调。 5.利用 microRNA与靶基因之间的靶向关系构建 microRNA-Gene调控网络分析结果显示,艾灸诱导神经发生的microRNA和核心基因分别是mmu-miR-466d-5p、mmu-miR-590-3p、mmu-miR-297b-3p,Dcx、Dclk1、Pten、Crebl、Sema3a、Fmr1、Foxg1、Hdac9、Robo2、Sema5a、Unc5c、Pafah1b1、Zfp91。 结论: 1.艾灸能有效影响快速老化小鼠SAMP8海马神经发生基因的表达,其中主要影响Apaf1、Dclk1、Efnb1、Epm2a、Gli3、Nrxn3、Reln基因; 2.艾灸能有效影响快速老化小鼠SAMP8海马microRNA的表达,其中主要影响miR-190、miR-715、miR-323-5p、miR-712*、miR-126-5p、miR-879*、miR-M1-2、miR-10b、miR-367、miR-450a-3p和miR-M1-7-5p; 3.艾灸可能是通过影响核心mircoRNA(mmu-miR-466d-5p、mmu-miR-590-3p、mmu-miR-297b-3p)和核心基因(Dcx、Dclk1、Pten、Crebl、Sema3a、Fmr1、Foxg1、Hdac9、Robo2、Sema5a、Unc5c、Pafah1b1、Zfp91)的表达来实现对神经发生分子网络调控。