黄河三角洲滨海湿地放线菌的分离培养,MLSA分析及一株新种的分类鉴定

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黄河三角洲是中国滨海湿地生态系统之中面积最大、最年轻、最完整的一个,其地处中国暖温带,具有丰富的自然生物资源。其由于黄河和海洋共同作用堆积而形成,加之此区域淡水资源供应不足,导致土壤水盐成分平衡失调,土壤呈现严重的盐碱化。由于黄河三角洲滨海湿地独特的地理位置与生态环境,使其存在着丰富的放线菌类群,其中不乏特殊放线菌类群,以及这些类群含有适应此区域盐碱环境的特殊代谢机制,这些都值得我们进一步去研究探讨。利用8种不同的培养基对黄河三角洲滨海湿地12个位点土壤样品进行分离纯化,最后获得80株放线菌,并对所得菌株进行16S rDNA全长序列测定。测定结果提交到EzBioCloud数据库并进行Blast比对,结果显示80个菌株分别属于8个属20个不同的种,表明黄河三角洲滨海湿地土壤样品放线菌多样性极为丰富。菌株OAct353与已发表的模式菌株最大同源性为97.43%,基本可以确定其为一个潜在的新种,其具体分类学位置还需结合其化学鉴定指标和生理生化指标才能确定。将纯培养所得菌株序列与最大同源性序列构建N-J系统发育进化树,发现发育树结构复杂,分支较多,链霉菌属和拟诺卡式菌在发育树中均处于处于一个大的独立分支,表明链霉菌属和拟诺卡式菌属属于该地区的优势菌群,但也有一些稀有菌属分布其中,因此说明黄河三角洲滨海湿地放线菌多样性丰富,潜藏大量的新种资源。从样品中分离的菌株OAct353,其菌落呈浅黄色,无孢子结构,无气生菌丝,细胞呈杆状,为革兰氏阳性菌。根据16S rDNA序列进行最大同源性比对,菌株OAct353与壤霉菌属(Agromyces)不同菌种的序列相似度在94%-97.43%之间,相似度最高的是Agromyces humatus CD5T、Agromyces subbeticus Z33T和Agromyces flavus CPCC202695T三株菌。DNA-DNA杂交结果显示,OAct353与这三株菌的亲缘值均不超过40%。(G+C)mol%含量为68%。主要甲基萘醌是MK-11(21%)、MK-12(74%)和MK13(5%)。主要脂肪酸是anteiso-C15:0(35%)、iso-C16:0(36%)和anteiso-C17:0(11%)。主要磷脂类脂有DPG、PG、PE和未知的GL。全细胞主要糖份有木糖、葡萄糖和鼠李糖。细胞壁氨基酸主要组分包括谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸。根据以上指标鉴定菌株OAct353(DSM28305)代表壤霉菌属的一个新种,并命名为Agromyces binzhouensis sp.nov。多位点序列分析(MLSA)作为一种高分辨率的分子分类方法,具有横向可比性、简便性和可重复性等优势。本实验通过文献和公共数据库提供的信息,确定了五个编码蛋白质的看家基因(atpD,gyrB,recA,rpoB和trpB)共同用于链霉菌MLSA研究,并确定了各基因的扩增引物。实验选取了6组,12个菌株作为实验材料,提取基因组DNA,对各基因片段进行扩增和测序。通过对各单基因位点的分析确定了各位点的适合性和单基因树的总体一致性,最终构建了多基因串联的系统发育树。利用MLSA和DNA-DNA杂交技术相结合对黄河三角洲滨海湿地和红树林湿地的两个土壤样品中已分得的菌株的16S rDNA亲缘关系相近的链霉菌进行进一步的区分,其对于地理学、分类学与发育进化学以及生态学均有一定的学术意义。
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