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第一部分SIRT1在钙化性主动脉瓣膜病中的作用目的:探究SIRT1在钙化性主动脉瓣膜病中的作用。方法:经华中科技大学同济医学院医学伦理委员会批准,收集正常主动脉瓣膜组织和CAVD主动脉瓣膜组织,免疫印迹检测SIRT1和成骨相关蛋白RUNX2的表达情况。8周龄ApoE-/-小鼠和52周龄ApoE-/-小鼠给予西方饮食干预16周后,硝酸银染色检测主动脉瓣膜钙化情况,心脏彩超检测血流动力学指标,免疫荧光检测主动脉瓣膜中SIRT1表达情况。分离培养人主动脉瓣膜间质细胞（AVICs）,通过免疫印迹检测P2代和P9代AVICs中SIRT1、衰老相关蛋白P21、成骨相关蛋白ALP、RUNX2的表达情况,茜素红染色检测钙结节形成情况。构建Sirt1fl/flCre TaglnApoE-/-小鼠和Sirt1tgApoE-/-小鼠。8周龄ApoE-/-小鼠和Sirt1fl/flCre TaglnApoE-/-小鼠给予西方饮食干预16周后,硝酸银染色检测主动脉瓣膜钙化情况,心脏彩超检测血流动力学指标。52周龄ApoE-/-小鼠和Sirt1tgApoE-/-小鼠给予西方饮食干预16周后,硝酸银染色检测主动脉瓣膜钙化情况,心脏彩超检测血流动力学指标。结果:CAVD主动脉瓣膜中SIRT1表达显著减少,RUNX2显著增加。与8周龄ApoE-/-小鼠相比,52周龄ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜中SIRT1表达减少,主动脉瓣膜钙结节增多,主动脉瓣口流速加快。与P2代AVICs相比,P9代AVICs中SIRT1表达显著减少,P21、ALP、RUNX2表达显著增多,钙结节形成增多。与ApoE-/-小鼠相比,Sirt1fl/flCre TaglnApoE-/-小鼠主动脉瓣膜钙结节增多,主动脉瓣口流速加快。与52周龄ApoE-/-小鼠相比,52周龄Sirt1tg ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜钙结节减少,主动脉瓣口流速减慢。结论:CAVD主动脉瓣膜中SIRT1表达减少。衰老能够下调ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜和AVICs中SIRT1表达,并加速ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜钙化,诱导AVICs向成骨样细胞分化。通过敲除和过表达ApoE-/-小鼠中SIRT1基因,证明SIRT1在钙化性主动脉瓣膜病中起保护作用。第二部分SIRT1调控AIM2炎症小体在钙化性主动脉瓣膜病中的机制研究目的:探究SIRT1调控AIM2炎症小体减轻钙化性主动脉瓣膜病的作用机制。方法:对小干扰RNA沉默SIRT1的AVICs进行转录组测序分析,对差异基因进行筛选、KEGG数据库及GO数据库富集分析。免疫印迹和免疫荧光检测人主动脉瓣膜组织中AIM2表达情况。8周龄ApoE-/-小鼠和Sirt1fl/flCre TaglnApoE-/-小鼠给予西方饮食干预16周后,免疫荧光检测小鼠主动脉瓣膜中AIM2表达情况。52周龄ApoE-/-小鼠和Sirt1tg ApoE-/-小鼠给予西方饮食干预16周后,免疫荧光检测小鼠主动脉瓣膜中AIM2表达情况。小干扰RNA沉默AVICs中的SIRT1后,ox-LDL干预72小时,免疫印迹检测ALP、RUNX2、AIM2表达情况。小干扰RNA同时沉默AVICs中的SIRT1和AIM2后,ox-LDL干预72小时,免疫印迹检测ALP、RUNX2表达情况。流式细胞术和免疫荧光检测沉默SIRT1后AVICs中线粒体ROS情况。mtDNA干预AVICs 24小时后,免疫印迹检测ALP、RUNX2、AIM2表达情况。线粒体ROS清除剂Mito-TEMPO干预沉默SIRT1的AVICs,免疫印迹检测ALP、RUNX2、AIM2表达情况。结果:SIRT1沉默组与对照组相比,共有1797个差异基因（DEGs）。KEGG信号通路富集分析显示差异基因高度富集在NOD样受体、Toll样受体、NF-κB信号通路。对NOD样受体信号通路进一步分析,发现SIRT1沉默组中AIM2炎症小体基因表达上调最显著。与正常主动脉瓣膜相比,CAVD主动脉瓣膜中AIM2表达显著增多。与ApoE-/-小鼠相比,Sirt1fl/flCre TaglnApoE-/-小鼠主动脉瓣膜中AIM2表达明显增多,Sirt1tgApoE-/-小鼠主动脉瓣膜中AIM2表达明显减少。沉默SIRT1后,ox-LDL干预AVICs,ALP、RUNX2、AIM2表达明显增高。沉默AIM2后,ALP、RUNX2的表达明显减低。沉默SIRT1后,AVICs中线粒体ROS明显增多。mtDNA干预AVICs后,ALP、RUNX2、AIM2表达明显增高。Mito-TEMPO干预沉默SIRT1的AVICs后,ALP、RUNX2、AIM2表达明显减低。结论:AIM2炎症小体参与钙化性主动脉瓣膜病。SIRT1通过下调AVICs线粒体ROS,抑制胞浆mtDNA激活AIM2炎症小体,抑制AVICs向成骨样细胞分化。第三部分SIRT1激活剂白藜芦醇在钙化性主动脉瓣膜病中的作用目的:探究SIRT1激活剂白藜芦醇在钙化性主动脉瓣膜病中的作用。方法:52周龄ApoE-/-小鼠单独给予西方饮食或西方饮食联合白藜芦醇干预16周后,免疫荧光检测小鼠主动脉瓣膜SIRT1、RUNX2及AIM2表达情况,硝酸银染色检测小鼠主动脉瓣膜钙结节情况,心脏彩超检测血流动力学指标。用白藜芦醇预处理AVICs后再给予ox-LDL干预,免疫印迹检测SIRT1、RUNX2及AIM2的表达情况,茜素红染色检测钙结节形成情况。结果:与单独给予西方饮食的ApoE-/-小鼠相比,西方饮食联合白藜芦醇干预的老年ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜中SIRT1表达明显增多,主动脉瓣膜钙结节明显减少,主动脉瓣口流速减慢,RUNX2、AIM2表达明显降低。白藜芦醇能够上调AVICs中SIRT1表达,同时抑制RUNX2、AIM2的表达,抑制AVICs向成骨样细胞分化。结论:白藜芦醇能够激活SIRT1,抑制RUNX2、AIM2的表达,减轻老年ApoE-/-小鼠主动脉瓣膜钙化,抑制AVICs向成骨样细胞分化,具有预防和治疗钙化性主动脉瓣膜病的临床转化前景。