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抗冷冻蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一类具有降低生物体液冰点和抑制冰晶生长的生物活性蛋白，在低温生物的生存中起着重要的作用。目前，已从鱼类、昆虫、植物、真菌中分离了许多抗冷冻蛋白基因，而应用较多的是鱼类抗冷冻蛋白基因，它已广泛用于转化鱼类、植物等并得到了表达。然而某些昆虫抗冻蛋白具有很高的生物活性，如从云杉卷叶蛾中克隆的抗冷冻蛋白，其活性是目前所有已知北极鱼抗冷冻蛋白活性的10-30倍，甚至100倍，因而昆虫的抗冷冻蛋白基因(afp)日益受到重视。 本研究以Primer afpF和Primer afpR为引物，从质粒pTHP4中克隆出afp基因，构建克隆载体pTHP5，再用NcoⅠ和PmlⅠ双酶切质粒pCMAMBIA3301和克隆载体pTHP5得到的大片段和目的片段连接，构建成大豆表达载体pCAAFP66。同时做了以下研究： 1.用农杆菌介导大豆胚尖和新型外植体，获得大豆抗性再生植株56株，通过PCR检测、Southern blot检测和除草剂抗性鉴定，证实其中32株抗冷冻蛋白afp基因已经整合进大豆基因组中。 2.比较三种不同外植体(子叶节、胚尖和新型外植体)的遗传转化结果，新型外植体的转化率最高，为9.09％，转化周期最短，大约50天；其次是胚尖，转化率为7.69％，转化周期大约50-60天；子叶节没有得到转基因植株，转化周期最长，为90-120天。 3.大豆遗传转化条件的确定： 预培养时间：不同材料预培养时间不一样，胚尖预培养最佳时间为24-36h，而新型外植体预培养最合适时间为24h。 共生培养温度：胚尖和新型外植体共生培养最适温度都是22℃，低于或高于22℃时转化率都有所下降。 农杆菌侵染胚尖的浓度和时间分别是0.5(OD600)和20h，而新型外植体侵染农杆菌浓度和时间分别1.5(OD600)和20h。 4.华春3号大豆幼苗在低温胁迫过程中，SOD、POD、CAT等3种保护酶活性均呈“先上升后下降”的趋势，而MDA含量和质膜透性保持上升，在随后的恢复培养过程中，温度越低越难恢复到处理前水平。这说明在低温伤害较轻的情况下，植物代谢系统通过增加保护酶的活性来减轻低温的伤害。而随着低温胁迫时间延长或胁迫温度过低，植物受到伤害的程度加剧，超过一定的限度，植物体内保护酶合成系统受到破坏，从而导致保护酶的活性降低。 5.低温胁迫下，华春3号幼苗叶片的可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量均呈“先上升后下降”的趋势，在随后的恢复培养过程中，温度越低越难恢复到处理前水平。说明低温胁迫较轻的情况下，大豆幼苗叶片积累渗透调节物质，降低细胞液的渗透势，以防止细胞过度失水而受到低温伤害，而随着低温胁迫时间延长或胁迫温度过低，植物受到伤害的程度加剧，超过一定的限度，植物细胞渗透调节物质降解或合成降低，从而导致它们的含量下降。 6.用0℃、5℃和10℃三个不同低温处理转抗冷冻蛋白大豆和华春3号，SOD、POD、CAT等3种保护酶活性均呈“先上升后下降”的趋势，MDA含量和质膜透性保持上升；转基因大豆酶活增加幅度大于华春3号，下降的幅度较小，而MDA含量和质膜透性保持变化趋势刚好相反，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量变化趋势和酶活变化趋势相似。说明转基因大豆在低温胁迫下能维持较高的抗氧化酶活性，MDA含量和质膜透性变化幅度小，细胞受伤较小，在恢复培养容易恢复到处理前水平；而华春3号在温度越低，胁迫时间越长，保护酶活性下降幅度大，导致MDA含量和质膜透性增加幅度大，渗透调节物质积累变少，在后期的恢复培养不能恢复。这说明转基因大豆在低温胁迫伤害较小。 7.低温胁迫的结果表明，把抗冷冻蛋白基因导入大豆，提高了大豆的抗寒性。