棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是一种杂食性害虫，寄主多达200余种，具有高繁殖力、高迁飞力和兼性滞育等生物学特性。近几十年来，已在全世界范围内对多种类型农药演化出抗性问题。上世纪90年代早期，棉铃虫拟除虫菊酯抗药性发展迅速，导致其在我国北方棉区大爆发。自1997年转基因Bt棉商业化后，抗性问题得到了一定程度的缓解。然而田间群落交替，非Bt靶标害虫如盲蝽等的猖獗，使得价格低廉、药效显著的拟除虫菊酯再次被频繁使用。目前，棉铃虫种群对氰戊菊酯已恢复高水平抗性，甚至一直处于敏感水平的西北棉区也显现出抗性。昆虫细胞色素P450介导的氧化代谢和酯酶介导的水解代谢能力增强以及钠离子通道功能性突变引起的靶标不敏感性是拟除虫菊酯抗性的主要原因。棉铃虫对拟除虫菊酯抗性机理研究主要集中于代谢抗性，氧化酶和酯酶解毒作用增强是主要抗性机理。但是，氧化酶和酯酶在代谢抗性中的相对贡献常常在棉铃虫不同地理种群中有明显差异。借助高通量测序技术以及成熟的生物信息分析工具，棉铃虫对拟除虫菊酯代谢抗性的分子机理还可进一步阐明。　　本文以棉铃虫SCD敏感品系和SCD-FenR氰戊菊酯抗性品系为研究材料，明确了氧化酶和酯酶解毒代谢增强在氰戊菊酯抗性形成中的关键作用，并排除了钠离子通道靶标基因与抗性相关的可能性。为了进一步研究代谢抗性的分子机理，采用基于测序的基因分型技术(Genotyping by sequencing，GBS)进行抗性QTL定位，同时进行抗性品系和敏感品系中肠和脂肪体的转录组分析。QTL和转录组数据的联合分析表明，氰戊菊酯抗性与2个遗传位点连锁，一个位于15号染色体，另一个位于8号染色体;在15号染色体上的抗性遗传位点附近有对氰戊菊酯具有解毒功能的氧化酶基因CYP337B3和酯酶CCE001基因簇（其中多个基因过量表达），在8号染色体上的抗性遗传位点附近存在一个与转录调控相关的组蛋白去乙酰化酶基因。此后，解析了CYP337B3在我国棉铃虫田间种群氰戊菊酯抗性中的贡献，并通过昆虫细胞表达系统证实了抗性品系中过量表达的酯酶基因CCE001g对氰戊菊酯具有解毒能力。　　1.代谢抗性和靶标抗性在棉铃虫SCD-FenR品系对氰戊菊酯抗性中的作用　　以棉铃虫氰戊菊酯抗性品系(SCD-FenR)和敏感品系(SCD)为试虫，通过交互抗性谱测定、增效剂生物测定和代谢酶活力比较，研究棉铃虫对氰戊菊酯抗性的生化机理。SCD-FenR对氰戊菊酯表现出654倍的高水平抗性，对其他拟除虫菊酯类药剂具有不同程度的交互抗性，而对其他类型药剂包括有机磷、氨基甲酸酯和Cry1Ac毒素等没有交互抗性。在抗性品系中，细胞色素P450抑制剂PBO和酯酶抑制剂DEF对氰戊菊酯分别有18倍和5倍的增效作用，而在敏感品系中则没有;谷胱甘肽转移酶GST抑制剂DEM在抗性和敏感品系中均无增效作用。与敏感品系SCD相比，SCD-FenR的ECOD和MROD单加氧酶活力分别是其6.3和53.9倍，均存在显著性差异;抗性品系的谷胱甘肽S-转移酶的DCNB及CDNB活力分别是敏感品系的2.2和2.3倍，而两品系间的酯酶活力水平相当（1.3倍）。电压门控钠离子通道是拟除虫菊酯类农药和DDT的作用靶标，已在多种昆虫中有报道与抗性相关。氨基酸序列比对和mRNA相对表达量比较两方面结果显示，多种可变剪接与氨基酸多态性在两个品系中为普遍现象，并没有发现已报道的kdr和super-kdr位点以及其他与抗性相关的功能性突变位点，而且钠离子通道基因的mRNA相对表达量在两个品系间也没有显著差异。因此，钠离子通道基因未参与棉铃虫氰戊菊酯抗性的形成，解毒代谢增强是棉铃虫氰戊菊酯抗性形成的主要机理。　　2.棉铃虫氰戊菊酯抗性相关基因QTL定位及其与转录组数据的联合分析　　利用HiSeq2000测序平台，对棉铃虫氰戊菊酯抗性品系及其对照品系的脂肪体和中肠组织分别进行了转录组测序。经序列比对合并分析后得到17106个基因，有847个基因的表达量在抗性、敏感品系间存在显著性差异（以2倍为限），其中763个基因为组织特异性表达差异。本研究主要分析了与抗药性相关的基因，包括细胞色素P450基因、羧酸酯酶基因、谷胱甘肽S-转移酶基因、蛋白酶基因、脂酶基因以及ABC转运蛋白基因。总体上，脂肪体中差异性表达的基因在数量和程度上均高于中肠。将SCD-FenR与SCD进行单对回交，后代用高低两个剂量氰戊菊酯处理后，获得低剂量死亡和高剂量存活两组极端表型样品各22头，用PstI消化单头F2样本的基因组DNA，然后进行简化基因组测序。利用Stack软件进行数据分析，获得可用于表型分析的13733个tags和6299个SNPs。将QTL定位区域与转录组数据进行联合分析，发现2个氰戊菊酯抗性遗传关联区域:一个定位于15号染色体上P450基因CYP337B3和酯酶基因簇CCE001之间的区域，CYP337B3已被报道与两种菊酯类药剂抗性遗传连锁，酯酶CCE001基因簇多数基因上调，可能与抗性相关;另一个定位于8号染色上，该区域存在一个组蛋白去乙酰化酶基因HDAC。上述结果为后续研究提供了有价值的重要线索。　　3.棉铃虫CYP37B3与氰戊菊酯抗性的关系及基于RNAi的功能验证　　2013年采集的7个田间种群均表现出高水平抗性(256-1182倍)，增效剂实验和代谢酶活性测定的研究结果均显示田间种群对氰戊菊酯的抗性机理以P450介导的代谢抗性为主，且P450酶活力与抗性水平显著相关。CYP337B3基因检测结果发现:该基因在对照敏感品系SCD中缺失，但所有田间种群中的CYP337B3v2等位基因频率高达96-100％。然而不论是不同种群之间，还是不同时期的同一种群中，该等位基因频率与抗性水平并不具备相关性。利用定量PCR检测4个抗性品系中CYP337B3v2mRNA相对表达量，结果表明，该基因表达水平也呈现不同程度的升高，但与抗性水平也不具备相关性。检测2008至2013年的4个田间样品和与室内退化品系的抗性水平与CYP337B3等位基因频率之间的关系，结论与之前相一致，两者的降低趋势也无相关性。比较了2013年7个田间种群CYP337B3的部分基因组序列（包含交叉位点及内含子），绝大多数(69/72)个体携带的为CYP337B3v2，另外鉴定到2个新的变体CYP337B3v3、CYP337B3v4。进一步地，以实验室筛选的氰戊菊酯抗性品系SCD-FenR为材料，通过喂食表达CYP337B3的dsRNA菌液的方法干扰了该基因的表达。结果显示，CYP337B3基因表达量敲减29-52％后，在2.40μg/头和19.6μg/头的处理剂量下，试虫对氰戊菊酯的敏感性与对照组相比分别增加了13％和21％。以上结果表明，CYP337B3基因在中国棉铃虫氰戊菊酯抗性形成中具有一定贡献，但还存在其它更重要的解毒代谢因子。　　4.棉铃虫氰戊菊酯抗性相关基因CCE001g功能表达验证　　根据比较转录组学分析的结果，筛选出与氰戊菊酯抗性相关的酯酶基因CCE001g。对SCD-FenR和SCD品系进行基因克隆及序列比对，发现CCE001g基因全长2391bp，开放阅读框共编码796个氨基酸，其推导的蛋白序列具备保守的催化三联体结构，在N端有一个信号肽。CCE001g属于GPI-锚定蛋白，存在两个潜在的N-糖基化位点。利用Bac-to-Bac系统，在Sf9昆虫细胞系中对CCE001g进行表达。酯酶活性染色及Western blot结果表明，CCE001g表达成功。CCE001g重组蛋白对氰戊菊酯的降解速率为2.683pmol/min/mg protein。上述结果表明，CCE001g酯酶具备对氰戊菊酯降解能力，该基因的过量表达对氰戊菊酯抗性产生具有一定贡献。　　综合全文研究结果，我们认为解毒代谢增强是棉铃虫氰戊菊酯抗性形成的主要机理，位于15号染色体上的CYP337B3和CCE001亚家族基因对中国棉铃虫氰戊菊酯抗性形成具有一定贡献。此外，发现位于8号染色体上与抗性相关的一个组蛋白去乙酰化酶基因，该基因可能与转录调控相关，其功能有待进一步研究。本研究中采用的将QTL定位与转录组数据进行关联分析的方法为昆虫代谢抗性机理研究提供了一个有效的新途径。