白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤之一。其发病机制目前尚不十分清楚。该病的主要特点是大量失去正常定向分化功能的非成熟的白血病细胞在体内堆积而产生造血异常。因此，诱导白血病细胞从未分化状态重新进入分化轨道，是白血病治疗的一个新思路。白血病抑制因子(LIF)是体内一种天然的、多功能细胞因子，对白血病细胞，如：HL-60、U937、M1等有诱导分化和增殖抑制作用。然而，白血病细胞增长快速且对LIF的感应能力差，使得机体内有限的LIF无法抑制白血病细胞的恶性繁殖。而外援性非生理剂量的LIF对脂肪细胞、内分泌细胞和生殖细胞等有细胞毒性，同时还干扰了细胞因子间的协调作用，所以它的药用价值不能得到体现。LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体完成的。LIF受体包括一个α亚基（gp190）和一个β亚基（gp130）。Tomida等研究发现，在没有gp130亚基存在的情况下，LIF受体gp190亚基胞内区也能形成同源二聚体，激活细胞内的STAT3。进一步研究证实，在gp190亚基的胞内区含有3个重要功能域，即：BOX1、BOX2和BOX3。其中，BOX3及其羧基末端（C-末端）含有3个YXXQ官能体（Y-酪氨酸，Q-谷氨酰胺，X-任意氨基酸），YXXQ可以识别STAT3的SH2位点，并与SH2位点特异性结合，是STAT3磷酸化的必须结构。而Porter等人研究发现，IL-7受体α亚基的游离T片段可以激活STAT5和PI3K等激酶，加快成T细胞分裂，并延长其成活时间，促进T细胞发育。这一研究表明，单一亚基的单一信号启动位点在游离状态下能够在细胞内启动相应的信号传导途径。综上所述，为了充分发挥LIF抗白血病的作用，又规避它的细胞毒性。我们按照LIFRgp190亚基胞内区C-末端设计了一个小分子即：190CT3（包含BOX3功能域及其羧基末端）。我们期望研究，在没有LIF刺激的情况下，过表达外源性的190CT3是否能替代LIF，激活胞内的信号通路，对细胞的增殖分化情况产生影响。在前期的研究中我们已经观察到：过表达190CT3的HL-60细胞株出现了增殖抑制的现象，然而其中的相关分子机制还不甚明了。在本研究中，我们将进一步深入研究190CT3对HL-60细胞的作用并探讨其相关分子机制。为白血病的治疗提供相关理论依据。首先，我们将190CT3目的基因片段装载到带有GFP绿色荧光蛋白标记的去内毒素穿梭质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上。分别用制备的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-190CT3和空载体慢病毒颗粒感染HL-60细胞，获得稳定表达190CT3-GFP及GFP空载体的HL-60细胞株，并设野生型HL-60细胞为空白对照，通过细胞周期检测、台盼蓝染色细胞活力检测、绘制生长曲线等比较各组细胞的增殖情况，通过流式细胞术观察各组细胞表面成熟粒细胞相关抗原CD15、CD11b的变化，透射电镜检测、细胞化学检测（瑞氏染色、α-NAE染色、NBT实验），比较细胞的形态、吞噬能力、还原能力，分析细胞的分化状态。结果显示：190CT3转染组HL-60细胞发生G0/G1期阻滞，增殖受到抑制。其粒细胞表面标志CD15、CD11b的表达增高，与对照组相比，核质比减小、细胞器增多，溶酶体增多，出现杆状和分叶状；α-NAE染色出现少量弱阳性细胞且阳性不被NaF抑制、NBT实验中阳性细胞明显增加，表明细胞的吞噬能力、还原能力增强。以上结果说明190CT3转染组HL-60细胞增殖受到抑制，且向有功能的成熟粒细胞分化。在上述工作的基础上，190CT3促进HL-60细胞分化和生长抑制的相关分子机制是我们下一步研究的重点内容。白血病细胞与残存的正常造血细胞存在于同样的骨髓微环境中却表现出截然不同的生物学特性，正常的造血细胞在细胞因子的作用下不断的分化成熟，而白血病细胞则表现为无限增殖、分化受阻。提示：细胞内信号通路异常在白血病的形成中起着重要的作用。越来越多的证据表明JAK/STAT通路异常激活在白血病的病理机制中有着重要的地位。STAT3是JAK/STAT信号途径中的一个重要的信号分子。最近的研究发现，STAT3的激活对细胞的生长、凋亡、细胞周期调控都有着重要影响。而STAT3自身又受细胞内多种信号转导途径的调控。在许多实体肿瘤和血液肿瘤中均发现STAT3被持续活化。所以，STAT3的激活可能与肿瘤发生发展的机制相关，已成为JAK/STAT的研究重点。在多数急性髓性白血病病人中STAT3的Tyr705和Ser727位点被组成性激活。其中，705位的酪氨酸发生磷酸化是STAT3发挥功能所必需的，而727位丝氨酸磷酸化有助于STAT3发挥最大转录活性。针对STAT3蛋白的肿瘤靶向治疗在白血病的治疗中有着良好的应用前景。STAT3存在有两个亚型，一个是全长的STAT3α（即我们通常所说的STAT3），一个是被截短的STAT3β。STAT3β与STAT3α相比在C末端缺失55个氨基酸残基，而被7个新的氨基酸残基所替代。STAT3β虽然缺乏Ser727位点，但是包含有Tyr705位点。该位点的磷酸化促使STAT3β发生二聚化， STAT3β二聚体具有比STAT3α二聚体更强烈的DNA结合活性。所以，STAT3β不仅仅是STAT3α的显性负性突变，它还可以调控基因的表达，STAT3β的过表达可以抑制STAT3α的功能。这两种类型在细胞中的动态平衡会影响细胞基因活化的形式，从而使STAT3表现出多效性。那么，是否190CT3的过表达改变了HL-60细胞中STAT3α和β的表达及磷酸化状态，从而影响了细胞的增殖和分化？为此，我们通过RT-PCR、免疫印记和免疫荧光技术检测了各组细胞中STAT3α和β的mRNA水平、蛋白表达水平以及跟信号转导密切相关的Tyr705、 Ser727的磷酸化水平及其细胞内分布情况。结果发现，实验组细胞中STAT3β的表达及其Tyr705磷酸化水平明显升高且表现为核内聚集，而STAT3α的表达及其Tyr705磷酸化水平没有明显变化，但Ser727的磷酸化水平降低，且主要被滞留在胞质中；而三组细胞中STAT3α和β的mRNA水平没有明显改变。同时，我们还通过免疫印记研究发现三组细胞中JAK1蛋白和磷酸化水平没有明显变化，但190CT3诱导的HL-60细胞中ERK1/2的磷酸化水平下降。以上结果提示①外源性过表达的190CT3对HL-60细胞中STAT3α和β的影响主要来自于翻译水平及翻译后蛋白的磷酸化状态的调控，190CT3促进了STAT3β的表达及其Try705位点的磷酸化水平升高。STAT3β二聚化后入核，能产生比STAT3α二聚体更强烈的DNA结合活性，抑制STAT3α的功能。但190CT3对STAT3α和β的转录水平没有影响。②Ser727残基是MAPK的磷酸化位点，外源性过表达的190CT3能够使ERK1/2的磷酸化水平下降，从而降低STAT3α Ser727位点磷酸化水平，进而降低STAT3α本身与DNA的结合能力。以上两个方面协同作用，抑制了STAT3α下游基因的表达。而该过程没有JAK1蛋白的参与。为了进一步证实190CT3与STAT3的相互关系，本研究通过免疫共沉淀，在提取的蛋白样品中相继加入LIFR（190CT3）抗体和Protein A Agarose后形成沉淀物，经SDS-PAGE电泳和转膜后，分别用LIFR（190CT3）抗体、STAT3抗体（检测总STAT3含量，包括磷酸化及非磷酸化的STAT3α和STAT3β）进行免疫识别，在重组190CT3慢病毒感染的HL-60细胞中分别检测到相对分子量约17KD和分子量约79KD、86KD（STAT3α和STAT3β）的蛋白条带。LIFR（190CT3）抗体可以将190CT3和STAT3α、STAT3β同时沉淀下来，证明190CT3与STAT3α、STAT3β之间存在相互作用。用同样的方法检测190CT3与p-STAT3之间的相互关系，在提取的蛋白样品中相继加入LIFR（190CT3）抗体和Protein A Agarose后形成沉淀物，经SDS-PAGE电泳和转膜后，分别用LIFR（190CT3）抗体和p-STAT3（即p705-STAT3）抗体（检测总p-STAT3，包括p-STAT3α和p-STAT3β）进行免疫识别。结果显示，在重组190CT3慢病毒感染的HL-60细胞中分别检测到相对分子量约17KD和分子量约79KD、86KD（p-STAT3α和p-STAT3β）的蛋白条带，LIFR（190CT3）抗体可以将190CT3、p-STAT3α、p-STAT3β同时沉淀下来。以上结果提示190CT3与STAT3之间存在相互作用，190CT3可以和STAT3结合，从而使STAT3β蛋白的表达及磷酸化水平升高，过表达的STAT3β二聚化后与STAT3α竞争性入核与DNA结合，而P-STAT3α被滞留在胞质，从而抑制了STAT3α的功能，表现为抑制HL-60细胞的增殖促进其分化。STAT3β蛋白的表达及磷酸化水平的升高，推测是由于190CT3与STAT3α的结合促进了STAT3α的剪切而引起的。这一部分内容还有待进一步研究证实。为了进一步探讨STAT3α和β的表达及活化状态对其下游增殖分化相关基因的影响，我们通过流式细胞术分析了粒系分化的关键调节蛋白PU.1、 C/EBPε，细胞从G1期进入S期的关键激酶cyclinE、CDK2的mRNA水平，结果显示实验组细胞中PU.1、C/EBPε的mRNA水平升高， cyclinE、CDK2的mRNA水平降低。免疫印记检测发现癌基因c-myc的表达下降。提示cyclinE、CDK2的表达降低使细胞周期阻滞于G0/G1期，HL-60细胞增殖受到抑制。癌基因c-myc的表达降低，有利于细胞的分化，而PU.1、C/EBPε在190CT3诱导的粒系分化过程中发挥重要作用。总之，本研究发现，一个新型的小分子——190CT3可以抑制HL-60细胞增殖，促进其向粒系分化。其可能机制有两个方面：（1）190CT3促进了STAT3β的表达及磷酸化。二聚化的STAT3β可以竞争性结合STAT3α的DNA结合位点，抑制STAT3α促进细胞增殖的作用，促进HL-60细胞向粒系分化。（2）在此过程中，ERK1/2的磷酸化水平降低，引起STAT3α Ser727位点磷酸化水平下降，从而降低STAT3α本身与DNA的结合能力。降低其下游癌基因的表达。