阿维菌突变株的复筛及其相关基因的比较分析

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本研究前期进行了阿维菌素菌株(streptomyces.avermitilis)的诱变改良工作。在该工作基础上进行突变菌株复筛,得到一株阿维菌素高产突变菌株(streptomyces.avermitilis) AV-326,并研究建立了AV-326菌株孢子悬液接种方式;对高产菌株S.avermitilis AV-326及其诱变出发菌株S.avermitilisAV-95的6个与阿维菌素合成和调控相关的基因(aveD,aveC,vdh,aveI,rrdA,wblA)进行了克隆测序和序列比对分析,在分子水平上比较了核酸序列和氨基酸序列的差异;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对两个菌株中上述基因在不同发酵时期(36h,48 h,120 h,240 h)的相对表达水平进行了定量检测和比较分析。本研究分为三个部分:  第一章:阿维菌素突变株的复筛及孢子悬液接种方式的建立。实验室前期进行了阿维链霉菌诱变育种及高通量筛选研究,初筛得到了大量突变株。本研究在此基础上进行了菌株复筛,得到一株阿维菌素高产菌株(S.av erm itilis AV-326),并以其为试验材料,建立了孢子悬液接种作为新的种子液接种方式:菌种斜面在28℃培养5d,4℃储存3周;适宜的孢子接种浓度为7.5×105个/mL种子液。  第二章:阿维菌素合成和调控相关基因的克隆测序和序列比对分析。对阿维菌素高产菌株(S.avermitilis AV-326)及其出发菌株(S.avermitilis AV-95)的6个可能与阿维菌素合成和调控相关的基因(aveD,aveC,vdh, aveI,rrdA,wblA),进行了PCR克隆,测序和比对分析。结果显示,6个目标基因中,只有基因aveD编码的氨基酸序列在高产菌株和出发菌株中存在一个氨基酸(第106位)的差异。该位点位于AveD的功能域内,但是该位点的差异是否会引起基因功能的变化还需要进一步验证和研究。其他5个基因的序列,在AV-326和AV-95菌株中则完全一致。  第三章:阿维菌素合成和调控相关基因的相对表达水平比较分析。以阿维菌素高产菌株(S.avermitilis AV-326)及其出发菌株(S.avermitilis AV-95)为材料,应用RT-qPCR技术对第二章研究的6个基因(aveD,aveC,vdh,aveI,rrdA,wblA)在不同发酵时期(36 h,48 h,120 h,240 h)的相对表达水平进行了定量检测和比较分析。结果显示,在阿维菌素合成阶段(48 h,120 h,240h)高产菌株中基因aveD的相对表达水平始终低于出发菌株;基因aveC在高产菌株中120 h的相对表达水平高于出发菌株;基因vdh在两个菌株中的相对表达水平无差异;基因aveI,rrdA在高产菌株中120 h和240 h时的相对表达水平均低于出发菌株;高产菌株中基因wblA在阿维菌素合成阶段(48 h,120 h,240 h)的相对表达水平显著低于出发菌株。上述结果提示,高产菌株中基因aveD表达水平的降低可能阻碍了B组分向A组分的转化,从而有利于B组分的积累;基因aveC可能对1类组分的合成起正调控作用;基因vdh与高产菌株S.avermitilisAV-326中阿维菌素的高产可能无直接关联;基因aveI对阿维菌素合成起负调控作用,与已有文献报道相符;基因rrdA和wblA对阿维菌素的合成可能起负调控作用。但对于基因aveC,rrdA和wblA对阿维菌素生物合成的调控作用及其机制还需要验证和进一步研究。本研究结果显示,可以它们作为靶标基因进行进一步的菌株改良研究。
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