PGRN通过mTOR信号通路促进宫颈癌细胞迁移与侵袭

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宫颈癌作为最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,已成为15-44岁女性的第二杀手,仅次于乳腺癌。2012年全球新发宫颈癌超过50万例,其中85%以上发生在发展中国家,死亡病例超过26万例。大量证据证明高危型HPV感染是宫颈癌致癌机制中的关键因素,但仅有很少部分的HPV女性感染者发展为宫颈癌,提示其他一些因素促进了宫颈癌的进展。癌细胞恶性进展的主要特征包括:生长信号自给、生长抑制信号耐受、逃脱程序性死亡、无限的复制潜能、持续的血管生成、组织侵袭与转移。转移是肿瘤进展的终极且最凶险阶段,超过90%的癌症患者死于转移而非原发性肿瘤。宫颈癌的进展阶段性明显,包括正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、原位癌、局部侵袭性癌和远处转移癌。早期宫颈癌(Ⅰa期-Ⅱa期)患者一般预后较好,但其中1/3死于转移和复发,晚期特别是有远处器官或淋巴结转移的宫颈癌(Ⅱb期-Ⅳ期)患者则难以达到根治目的。盆腔淋巴结转移是宫颈癌的重要扩散途径,有无淋巴结转移直接影响患者的预后。探讨宫颈癌的侵袭和转移的机制对增强疗效、防止复发和提高患者生存质量具有重大意义。癌细胞转移分为多个步骤,包括癌细胞从原位肿瘤脱离,侵入周围组织,内渗入血管或淋巴管,随血流或淋巴系统散播,最终外渗并在远端器官生长。每一步骤均需要独特的分子程序的参与,其中癌细胞黏附与迁移的调控和细胞骨架性质发挥重要的作用。此外,肿瘤转移的起始与癌细胞形态学改变,即上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有关。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种新型多功能生长因子,具有促进细胞增殖、生存、迁移、抗炎等功能特点,参与多种重要的生理和疾病进程。PGRN最初被鉴定为癌细胞的生长因子,在许多肿瘤中高水平表达,与肿瘤的不良预后相关,并介导乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌等的发生与发展。PGRN与癌细胞侵袭转移关系密切,可增强成纤维细胞的运动能力,驱动SW13和MCF-7细胞穿过基质胶滤膜,刺激乳腺癌细胞产生血管内皮生长因子和血管生成素,并可促进癌细胞基质金属蛋白酶的产生等,而近期的研究发现PGRN可通过增强EMT程序介导卵巢癌细胞的迁移与侵袭。我们的前期研究首次报道了 PGRN作为肿瘤微环境因素在宫颈癌中高表达,并促进宫颈癌细胞恶性增殖与转化。然而,PGRN在宫颈癌细胞的迁移与侵袭中的功能,以及PGRN对癌细胞迁移、侵袭关键机制的调控作用仍未见报道。目的:本论文旨在明确PGRN在宫颈癌细胞运动、迁移与侵袭中的功能;分析PGRN对宫颈癌细胞EMT和细胞骨架重排的影响,探索PGRN促进宫颈癌细胞迁移的分子机制。方法:利用重组人 PGRN(recombinant human PGRN,rhPGRN)处理宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa)使用划痕修复实验、transwell迁移和侵袭实验,检测PGRN对宫颈癌细胞运动、迁移和侵袭能力的影响;免疫印迹法分析EMT相关蛋白谱表达的变化;比较正常宫颈组织和宫颈癌组织中PGRN和p-mTOR的蛋白水平表达变化及其相关性,检测mTOR下游蛋白的激活及PGRN调控mTOR的分子机制;采用F-actin免疫染色和激光共聚焦显微镜观察,表征宫颈癌细胞迁移相关细胞结构的改变;蛋白水平分析细胞骨架重排相关LIMK/cofilin信号途径的活化水平及FAK等信号分子的磷酸化,并分析PGRN对Rho小GTP酶活性的影响;利用FAK、Rho小GTP酶等的抑制剂,分析PGRN调控宫颈癌细胞迁移与侵袭对FAK和Rho小GTP酶的依赖性。结果:rhPGRN能够增强宫颈癌细胞运动、迁移和侵袭能力;PGRN对宫颈癌细胞EMT的影响较小,但可促进细胞骨架重排,表现为压力纤维增强、板状伪足和丝状伪足增多等;PGRN通过TNFR2激活mTOR信号通路,且在宫颈癌组织中与p-mTOR具有相关性,雷帕霉素抑制mTOR降低了宫颈癌细胞的迁移与侵袭;PGRN可激活细胞骨架重排相关的LIMK/cofilin信号途径,同时促进FAK的磷酸化水平增强;PGRN通过mTOR信号途径增强宫颈癌细胞中RhoA和Racl的活性,PGRN介导的宫颈癌细胞迁移和侵袭依赖于FAK、Racl和RhoA等的活化。结论:本论文证实了 PGRN具有促进宫颈癌细胞运动、迁移与侵袭的能力,首次发现PGRN主要通过mTOR信号途径促进细胞骨架重排能力调控癌细胞迁移,并深入分析了 FAK和mTOR活化的Rho小GTP酶介导的信号途径在其中的重要作用。这一研究发现了 PGRN促进宫颈癌侵袭转移,从而参与宫颈癌恶性进展的新机制,为控制宫颈癌侵袭转移提供了新的靶点;本研究首次提出PGRN对细胞骨架重排的调控作用,并将PGRN介导的FAK与Rho/LIMK/cofilin信号途径联系起来,为PGRN信号通路及生物学功能研究提供了新的视角。
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