研究背景与目的硬皮病是一种慢性自身免疫性疾病,以多脏器炎症和弥漫性纤维化为特征。其病因及发病机制不明,目前认为硬皮病患者的皮肤纤维化是由于成纤维细胞过度活化导致胶原、纤维连接蛋白和糖胺聚糖等细胞外基质的沉积增加所造成。硬皮病早期,炎症反应是其主要表现,也是进一步促进成纤维细胞活化并合成细胞外基质的主要因素。其中,细胞因子网络失衡,如肿瘤坏死因子-alpha (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和白介素-1beta (interleukin-1beta, IL-1β)等多种促炎症因子参与了成纤维细胞的活化。因此,抑制炎症信号通路可能有望阻断硬皮病的病情进展。近期研究发现沉默调节蛋白1(silent information regμlator1, Sirtl)可能通过抑制NF-κB的转录活性,下调多种炎症相关因子的表达,从而缓解炎症。此外,Sirtl具有调节免疫和调节细胞分化、增生的功能。白藜芦醇(resveratrol,Res)是一种多酚类天然植物抗毒素,为Sirtl的激动剂之一。研究认为白藜芦醇有明显抑制炎症、调节免疫的作用,鉴于近期有研究报道白藜芦醇可能不直接通过激活Sirtl而发挥作用,因此其机制是否依赖于Sirtl仍有待进一步探讨。本文通过对博来霉素诱导的C3H/He小鼠硬皮病模型和3T3/NIH小鼠胚胎成纤维细胞的研究,阐明Sirtl及其激动剂白藜芦醇在硬皮病中的抗炎症、抗纤维化作用,并探讨二者的作用机制。研究内容与方法体内研究：C3H/He小鼠背部皮下注射博来霉素(0.2mg/ml,100μl),每日一次,连续三周,诱导硬皮病小鼠模型。取小鼠背部注射点局部病变皮肤组织,用HE染色和Masson特殊染色鉴定硬皮病小鼠发病情况,免疫组织化学法和酶联免疫吸附法(ELISA)检测Sirt1表达的变化。于不同时间点给予不同剂量的白藜芦醇干预治疗(腹腔注射)硬皮病,每日一次,四周后处死小鼠,通过HE染色和Masson特殊染色观察病变皮肤组织病理变化,RT-PCR检测小鼠皮肤组织中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)、IL-6,诱生型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)的表达改变。体外研究：应用重组鼠源TNF-α刺激3T3/NIH小鼠胚胎成纤维细胞,诱导体外细胞炎症模型；于TNF-α刺激前后的不同时间点给予不同剂量白藜芦醇处理细胞,并通过明胶酶谱法、Western印迹法和real-time PCR检测MMP-9、IL-1p、IL-6和iNOS的表达变化以及NF-κB亚单位RelA/p65乙酰化水平的改变。为进一步探索Sirtl炎症抑制作用的具体机制,我们应用siRNA干扰技术阻断Sirtl在成纤维细胞中的表达,同样条件下再给予白藜芦醇和TNF-a处理细胞,检测上述炎症相关因子表达水平和RelA/p65乙酰化水平的变化；此外,通过Western印迹法检测mTOR通路在TNF-a诱导的炎症中的变化,以及Sirtl对该通路的调节作用。研究结果体内研究：博来霉素诱导的硬皮病小鼠背部病变皮肤的组织学检查可见明显炎症细胞浸润,皮肤真皮层变性、增生、纤维化,皮肤厚度增加,胶原沉积；real-time PCR结果显示病变皮肤组织中MMP9、IL-6和iNOS的mRNA表达明显增加：ELISA和免疫组织化学检测发现硬皮病小鼠病变皮肤组织中Sirtl表达水平升高。给予Sirtl激动剂白藜芦醇治疗后,上述病理病变明显缓解,胶原沉积减少,炎症浸润缓解,上调的MMP9、IL-6和iNOS mRNA表达也被抑制；白藜芦醇这种抑制炎症的作用呈剂量和时间依赖性,尤其在博来霉素刺激之前开始给予白藜芦醇预防治疗,可明显抑制博来霉素诱导的炎症、纤维化反应。体外研究：重组鼠源TNF-α可诱导成纤维细胞炎症反应,包括MMP9、IL-1p、iNOS、IL-6的表达上调,呈时间和剂量依赖性。给予白藜芦醇干预处理细胞后发现：白藜芦醇可显著抑制TNF-a诱导的MMP9分泌,呈剂量依赖性；同时,白藜芦醇也下调TNF-a诱导的IL-1β、iNOS、IL-6mRNA表达,尤其是在TNF-α刺激前1小时预处理,效果明显优于炎症后处理。TNF-α可诱导3T3/NIH成纤维细胞NF-κB亚单位Re1A/p65的乙酰化,呈时间依赖性,在TNF-α刺激后30分钟RelA/p65赖氨酸310位点的乙酰化水平开始升高,并于刺激后3～9小时达高峰。白藜芦醇抑制炎症的同时,也可明显下调RelA/p65的乙酰化,表明其去乙酰化作用。为探索Sirtl在白藜芦醇去乙酰化中的重要作用,应用siRNA干扰技术阻断Sirtl表达,于同样条件下给予TNF-a和白藜芦醇处理细胞,发现白藜芦醇的去乙酰化作用被明显抑制,其缓解炎症的作用也被阻断,说明白藜芦醇可能通过对RelA/p65的去乙酰化作用抑制炎症反应,而该作用依赖于Sirtl的表达。另外,TNF-α可诱导成纤维细胞中的mTOR (mammalian target of rapamycin)和S6RP (S6ribosomal protein)磷酸化反应,于刺激后1/2小时～3小时达到高峰,并在24小时内逐渐降至正常。白藜芦醇可下调炎症高峰期mTOR和S6RP的磷酸化水平；给予mTOR特异性抑制剂雷帕霉素同样可以抑制mTOR和S6RP的磷酸化,并下调TNF-a诱导的MMP-9和IL-1β表达。研究结论1.脱乙酰化酶Sirtl有抑制炎症、缓解纤维化的作用,因此上调Sirtl的活性或表达可能在硬皮病治疗中有一定作用。2.作为Sirtl激动剂,白藜芦醇对硬皮病有一定的治疗作用,早期干预或预防治疗可能更有效,其作用机制依赖于Sirtl。3. Sirtl抑制炎症、改善纤维化的机制之一可能是抑制NF-κB亚单位RelA/p65赖氨酸310位点的乙酰化,抑制NF-kB的转录活性；而抑制mTOR和S6RP磷酸化也可能是Sirtl发挥作用的另一重要机制。