猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度传染性疾病,临床症状主要表现为肠炎、呕吐和水样腹泻,导致仔猪的高死亡率,出生1至3天的仔猪死亡率可达100%,此后降低到大约10%,死亡率平均为50%。我国在1976年第一次出现PED,2010年起大规模爆发本病,严重影响养猪行业健康发展。PEDV根据纤突蛋白(S蛋白)可以分为G1亚型和G2亚型,疫苗株CV777属于G1亚型,而2010年起在我国爆发的PEDV野毒属于G2亚型,因此传统的CV777疫苗不能对猪起到良好保护作用。目前市场上的ELISA检测试剂盒只针对G1亚型,养殖场不能实现对PEDV野毒大批量检测。本研究旨在通过构建PEDV S蛋白的原核和真核表达载体,使用原核表达蛋白免疫小鼠,研制抗PEDV S蛋白单克隆抗体,为今后PEDV的防控和建立检测PEDV S蛋白ELISA方法提供生物材料。主要研究内容和研究结果包括以下两部分:1.PEDV S蛋白的体外表达本研究通过比对经典的G1亚型毒株和G2亚型毒株S蛋白氨基酸序列,发现G2亚型毒株S蛋白氨基酸序列与G1亚型相比,存在缺失、插入和突变,集中在第27～266位氨基酸。为获得表达PEDVS蛋白第18～312AA(第52～936nt)的原核及真核表达质粒,本研究通过提取PEDV-JS1株RNA,反转录获得cDNA,应用PCR扩增目的基因,通过胶回收、酶切、连接和转化等试验,构建重组质粒pGEX-S和pcDNA3.1-S。将测序正确的原核表达重组质粒pGEX-S转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态,在IPTG终浓度为0.25mmol/L条件下,37℃、225rpm诱导5h,超声波破碎后进行SDS-PAGE和Western-blot验证,结果表明,重组菌沉淀出现一条分子量为59kDa的目的蛋白条带,与预测融合蛋白大小一致。优化诱导条件,发现重组菌在16℃、150rpm条件下诱导20h,可获得可溶性表达,且IPTG浓度对蛋白表达量没有显著影响。可溶性蛋白经GST亲和层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot验证,结果表明成功获得纯化蛋白。同时,将测序正确的真核表达重组质粒pcDNA3.1-S瞬时转染293T细胞,应用IFA和Western-blot验证,结果表明真核表达重组蛋白能在293T细胞中表达。本研究成功表达了 PEDVS蛋白,为研制抗PEDVS蛋白单克隆抗体提供了免疫原和筛选方法。2.抗PEDV S蛋白单克隆抗体的制备为制备抗PEDV S蛋白单克隆抗体,本研究使用原核表达重组蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,间隔14天免疫一次,第4次免疫72h后进行细胞融合。将真核表达重组质粒pcDNA3.1-S瞬时转染293T细胞,利用IFA筛选杂交瘤细胞上清,结果表明有3株能够分泌抗PEDVS蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为PEDV-2B10、PEDV-4C3、PEDV-5B7。经过两到三次亚克隆,杂交瘤细胞达到100%分泌抗PEDVS蛋白特异性抗体。亚类鉴定结果表明PEDV-2B10和PEDV-4C3属于IgG1亚型,PEDV-5B7属于IgM亚型。单抗特异性鉴定表明,PEDV-2B10和PEDV-4C3均针对G2亚型PEDV。利用IFA对2株单抗腹水进行效价测定,结果表明PEDV-S-2B10的腹水效价达到3200倍,PEDV-S-4C3的腹水效价达到6400倍。分段表达PEDV S基因,构建4个含分段基因的真核重组质粒,分别转染入293T细胞并应用IFA和Western-blot对2株IgG1亚型单抗的抗原表位进行分析,结果表明PEDV-S-2B10针对的抗原表位在PEDV S蛋白的第18～88AA,PEDV-S-4C3针对的抗原表位在PEDV S蛋白的第248～312AA。本研究成功制备3株针对PEDV S蛋白单克隆抗体,为进一步研究PEDV S蛋白和建立检测PEDV S蛋白ELISA方法奠定了基础。