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本实验室于2003年从乳酸酸菜发酵液中分离出一株乳酸菌,并将其命名为Lactobacillus paracasei HD1.7。经研究发现,该菌发酵液中含有一种肽类物质,可以有效抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酿酒酵母,同年,Jiro Nakayama等人在L.paracasei E93490基因组中发现有群体效应组件存在的可能,并推测这些基因为拟群体效应调控系统相关基因,负责调控该菌株细菌素的生成。由此推测,L.paracasei HD1.7发酵液中的这种肽类物质可能为该菌株分泌的细菌素,且该菌中也存在负责调控细菌素生成的群体效应调控系统相关基因。迄今为止,人们对于L.paracasei细菌素的生成机理及其调控机制所知甚少,故对L.paracasei HD1.7细菌素调控基因的研究具有十分重要的意义。本研究首先依据Jiro Nakayama等人发表的L.paracasei E93490拟群体效应调控系统相关基因的序列,通过PCR方法对试验菌株中可能存在的拟群体效应相关基因—组氨酸蛋白激酶编码基因prcK和自诱导肽编码基因prcA进行扩增,结果显示,prcK基因长度为1299bp,并将序列提交到Genbank中;prcA基因长度为138bp,并将序列提交到Genbank中;同时通过生物信息学方法对这些基因的核苷酸组成、蛋白质构象等方面进行了预测和分析,寻找到prcK和prcA与文献报道的组氨酸蛋白激酶编码基因和自诱导肽编码基因之间的联系,这为后续研究拟群体效应相关基因的功能奠定了基础。其次,本研究利用基因敲除技术,以窄宿主范围质粒p2NIL和pUC18为骨架质粒,构建了5个可用于敲除prcK基因和prcR基因的自杀质粒pYTKLKRT、pYTKA、pYTRLRRT、pYTRT、pYTKRT。其中质粒pYTKLKRT、pYTKA用于敲除prcK基因,质粒pYTRLRRT、pYTRT用于敲除prcR基因,质粒pYTKRT用于同时敲除prcK基因和prcR基因。将这些质粒以电转化法导入试验菌株中。最佳的电转化条件:用含1%甘氨酸的MRS培养基培养菌体,当OD600为0.5-0.6时,用电转缓冲液AEB1处理菌体,电压选择9kv/cm,电击后迅速加入普通MRS培养基,复苏23h。自杀质粒通过电转化法被导入L.paracasei HD1.7中,经过同源重组,分别获得prcK敲除突变株、prcR敲除突变株和prcKprcR双基因敲除突变株,PCR法验证突变株,证明自杀质粒已被成功转入并发生指定位置的同源重组。抑菌试验测定显示prcK敲除突变株、prcR敲除突变株和prcKprcR双基因敲除突变株均比原始菌株的抑菌能力弱,其产生的细菌素效价分别为1527.50AU/ml、1577.39AU/ml和1267.48AU/ml,比原始菌株分别降低24.12%、21.65%和37.04%,说明prcK基因和prcR基因的敲除对突变株细菌素的生成产生了一定的影响。从而初步证明prcK基因和prcR基因很可能为调控L.paracasei HD1.7细菌素生成的群体效应三组分调节系统中的组氨酸蛋白激酶编码基因和反应调节因子。本研究通过构建prcK、prcR基因缺失突变株和prcKprcR双基因缺失突变株,为研究prcK和prcR基因功能以及L.paracasei群体效应作用机制、产肽机理奠定基础,从而有目的性地改变抗菌肽产生的调控过程,构建抗菌肽高产菌株,使L.paracasei HD1.7在较低浓度下亦可诱发表达大量抗菌肽,在理论上为群体效应现象提供了实例,为实现L.paracasei HD1.7抗菌肽天然防腐剂工厂化生产提供理论依据。