研究背景:众所周知,成年人的心肌细胞在病理状态下缺乏分裂增值能力,缺血性心脏病如急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)所致的心肌细胞丢失和瘢痕形成是导致顽固性心力衰竭乃至死亡的病理基础。目前,以培养的收缩性体细胞作为“补片”种植于受损心肌疤痕组织中进行心肌重建的细胞性心肌成形术(cellular cardiomyoplasty,CCM)被认为是一种很有前景的治疗手段。实施CCM需要解决的首要问题就是如何获得大量合适的可移植细胞。虽然将体外培养的心肌细胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓干细胞及胚胎干细胞等移植到心肌梗死后的疤痕组织中能够一定程度上改善心功能,但因自身存在的缺陷而限制了临床应用。生肌调节因子(myogenic determination,MyoD)基因是肌肉发生的主导调控基因,能够启动和促进包括成纤维细胞在内多种非肌细胞的肌生成。此外,CCM技术需要解决的另一个关键性问题就是如何实现移植细胞与原有心肌细胞之间的功能整合,这得依赖于移植细胞与原有心肌细胞之间缝隙连接介导的细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC),连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因表达可以使细胞之间的GJIC形成。近年来的研究表明通过基因工程将成纤维细胞改造成为可兴奋细胞是可能的;而真皮成纤维细胞(dermal fibroblast,DFs)是机体内数量最大的“种子细胞库”,因此,将组织工程技术与转基因技术相结合,通过MyoD和Cx43基因诱导DFs分化为具有GJIC功能的“心肌样”肌细胞,有望成为CCM一种新的“种子细胞”来源。目的:探讨体外MyoD和Cx43基因诱导大鼠DFs分化为“心肌样”肌细胞的生物学特性,并将其自体心肌局部注射移植至AMI大鼠的心肌梗死区内,观察心肌结构和心功能的变化。方法:(1)采用Ⅱ型胶原蛋白酶分离、培养大鼠DFs,并观察其体外生长的生物学特性;(2)构建携带大鼠MyoD和Cx43基因的真核表达质粒载体pLenti6/v5-DESTMyoD和pLenti6/v5-DEST-Cx43,并通过电泳和测序加以鉴定;(3)利用慢病毒表达系统,将MyoD和Cx43基因转染体外培养的DFs,诱导其分化为“心肌样”肌细胞;(4)观察MyoD和Cx43基因转染DFs后细胞形态学及超微结构的变化,并通过分子生物学手段确定MyoD和Cx43基因的转录与表达情况;(5)采取开胸术式结扎大鼠左冠状动脉前降支(left anterior descending coronaryartery,LAD)的方法建立大鼠AMI模型;(6)将体外诱导分化成功的“心肌样”肌细胞通过局部注射自体心肌移植到AMI大鼠的心肌梗死区内;(7)在细胞移植前和移植后4周内观察心电图和血浆脑钠素(BNP)浓度的变化;(8)于细胞移植4周后采用Langendorff离体心脏灌流和多外围设备转接器(MPA)信号采集分析系统评价大鼠左心室功能的变化,同时采用染色法测定心肌梗死面积(myocardial infarction size,MIS);(9)应用免疫组织化学技术检测5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记移植细胞在宿主心肌内的驻留存活及其connexin43蛋白的分布情况;(10)通过透射电子显微镜观察移植区内细胞的超微结构和缝隙连接形成情况。结果:(1)成功建立了高纯度大鼠DFs的体外培养模型,纯度达95%以上,波形蛋白免疫细胞染色为阳性;(2)电泳和测序结果证实已成功将大鼠MyoD和Cx43基因的全长序列cDNA片段克隆到慢病毒载体中,成功构建了真核表达载体pLenti6/v5-DEST-MyoD和pLenti6/v5-DEST-Cx43;(3)RT-PCR和Western blot检测出基因转染后细胞表达了MyoD和Cx43基因相应的产物;(4)免疫细胞化学检测显示MyoD基因转染成功的细胞肌动蛋白、结蛋白呈阳性及电子显微镜观察到Cx43基因转染成功的细胞间有缝隙连接形成;(5)通过结扎LAD,4周后能够形成梗死部位和MIS稳定的大鼠AMI模型;(6)细胞移植术后4周,MyoD和Cx43基因联合转染DFs诱导分化成功的“心肌样”肌细胞自体心肌内移植后,可以减少AMI大鼠的MIS、降低血浆BNP浓度、改善心脏的缩舒功能及心电图的异常程度;(7)免疫组织化学检测显示心肌梗死瘢痕区及边缘处细胞移植后有BrdU阳性细胞存在和connexin43蛋白分布;(8)MyoD和Cx43基因联合转染DFs诱导分化成功的“心肌样”肌细胞于心肌内移植后,透射电子显微镜下可观察到这些细胞之间有缝隙连接形成。结论:(1)MyoD和Cx43基因可以成功诱导体外培养的DFs分化为“心肌样”肌细胞;(2)这种分化成功的“心肌样”肌细胞经自体心肌移植后能够在宿主体内生长、增殖,并可在一定程度上减轻AMI大鼠心室重构的进程及改善心功能,且这种经心外膜途径移植是安全可行的。