目的心肌缺血是导致心脏功能异常及产生病变的主要原因之一,慢性心肌缺血可表现出心肌细胞损伤和凋亡的病理变化,导致心脏功能以衰退与衰竭而终结。西药治疗缺血性心脏病起效迅速,但长期服用容易引起耐药、低血压和负性肌力作用。针灸能够有效改善缺血性心脏病的临床症状,对心率失常、心功能有良好的调整作用,并且具有安全、无创、无不良反应和使用方便等优势。在冠心病研究中,代谢组学技术在冠心病诊断技术、早期诊断及中医辨证分型等方面已取得较好发展。将代谢组学运用于与代谢密切相关的心血管疾病的诊断和治疗中,为从整体上研究心血管病的病理机制、指导治疗提供了新思路,显示了良好的应用前景。目前代谢组学已在医学、药学以及生物学等相关领域广泛应用,但在针灸领域与代谢组学技术相结合的研究还比较少见。基于缺血性心脏病与体内代谢密过程切相关的特点,在前期工作的基础上,本实验以慢性心肌缺血模型大鼠为研究对象,选用标本配穴,取“内关”“关元”“足三里”穴,观测标本配穴对心肌缺血的效应,采用1H-NMR核磁共振代谢组学检测技术和模式识别方法,分析代谢产物的变化规律和参与穴位配伍效应的代谢途径,对电针干扰大鼠慢性心肌缺血的生物标志物进行有益探索,从整体上研究心血管病的病理机制,为临床治疗提供新的思路。方法采用3月龄Wistar雄性健康大鼠50只,体重180-220g,随机分为五组:正常组,慢性心肌缺血模型组,标本配穴电针组,SIRT1抑制剂组,SIRT1抑制剂+标本配穴电针组,每组10只。正常组:每日皮下注射5 mg/kg生理盐水,连续注射7天;慢性心肌缺血模型组:每日颈背部皮下注射5 mg/kg ISO,连续注射7天;标本配穴电针组:每日颈背部皮下注射5 mg/kg ISO,连续注射7天;给予电针内关、关元、足三里,共治疗21次;sirt1抑制剂组:每日于颈背部皮下注射5mg/kgiso,给予sirt1抑制剂水溶液(nicotinamide)灌胃,10mm/kg/d,共给予21次;sirt1抑制剂+标本配穴电针组:每日于颈背部皮下注射5mg/kgiso,同sirt1抑制剂组灌胃给药21次,针刺治疗同标本配穴电针组。针刺操作方法:标本配穴电针组取“关元”穴以及双侧“足三里”“内关”穴,同侧穴位(“内关”,“足三里”)组成一对接通电极,“关元”穴在相应穴位附近旁开0.5cm处再浅刺一针,作为辅助电极,连接hans-200型电针仪,疏密波,频率转换2-100hz,强度1ma,以大鼠肢体有明显震颤感为度。每次10分钟,每天一次,共治疗21天。所有大鼠实验结束后采集全部大鼠24小时尿液,待心电图观察及心功能检测结束后取材:心尖部取血提取血清,心脏下1/3心肌组织,显微镜下观察心肌细胞病理结构;放免法检测ldh、ck、ck-mb和ast含量;1h-nmr核磁共振技术对各组大鼠的血清与尿液样本进行代谢组学检测,并对数据结果进行统计分析。结果1.与正常组相比较,慢性心肌缺血模型组st段与t波振幅显著抬高(p<0.01);与慢性心肌缺血模型组比较,标本配穴电针组st段与t波振幅显著降低(p<0.05),而sirt1抑制剂组st段与t波振幅抬高(p<0.05),sirt1抑制剂+标本配穴电针组st段与t波振幅均有所降低,但差异不具有统计学意义(p>0.05);与sirt1抑制剂+标本配穴电针组相比,标本配穴电针组st段与t波振幅标本配穴电针组均降低(p<0.05),sirt1抑制剂组均增高,差异显著(p<0.05)。2.与正常组相比较,慢性心肌缺血模型组lvsp、+dp/dtmax及-dp/dtmax显著下降(p<0.01),lvedp及hr显著增高(p<0.01)。与慢性心肌缺血模型组相比,标本配穴电针组lvsp、+dp/dtmax及-dp/dtmax显著上升(p<0.05或p<0.01),lvedp及hr显著降低(p<0.05或p<0.01);sirt1抑制剂组lvsp指数明显下降(p<0.05),lvedp指数明显升高(p<0.05);sirt1抑制剂+标本配穴电针组+dp/dtmax及-dp/dtmax指数明显升高(p<0.05)及hr降低明显(p<0.05)。与sirt1抑制剂+标本配穴电针组相比,标本配穴组lvsp、+dp/dtmax及-dp/dtmax上升(p<0.05),lvedp及hr降低(p<0.05);sirt1抑制剂组lvsp、+dp/dtmax及-dp/dtmax降低(p<0.05),lvedp及hr增高(p<0.05)。3.正常组心肌细胞光镜下可见,结构正常,纤维明晰,细胞间质无浸润。慢性心肌缺血模型组光镜下可见,心肌细胞结构破坏、直径增大,纤维模糊,部分纤维化,肌原纤维断裂,细胞间结缔组织疏松水肿,可见炎性浸润,慢性心肌缺血模型制备成功。标本配穴电针组电镜下可见,心肌细胞损伤状况改善,心肌纤维化程度显著降低,细胞间质结构正常未见炎性浸润。sirt1抑制剂组与模型组相比较细胞破坏程度加重,纤维结缔组织增生,肌原纤维排断裂溶解,细胞间水肿严重。sirt1抑制剂+标本配穴电针组与sirt1抑制剂组相比较光镜下可见,损伤的心肌细胞有所修复,但心肌纤维仍有部分溶解增生。4.与正常组相比,慢性心肌缺血模型组ck、ck-mb、ast、ldh水平均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01)。与模型组比较,标本配穴电针组四项指标均显著降低(p<0.05);sirt1抑制剂组ck-mb、ck与ast升高明显(p<0.05);sirt1抑制剂+标本配穴电针组ck-mb、ck与ast指标均降低(p<0.05)。与sirt1抑制剂+标本配穴电针组相比,标本配穴电针组四项指标均降低,差异明显(p<0.05);sirt1抑制剂组ck、ck-mb、ast差异明显(p<0.05)。5.与正常组相比,心肌缺血模型组葡萄糖、脯氨酸相对浓度显著增加(p<0.001),丙酮酸含量明显下降(p<0.05)。与心肌缺血模型组相比,标本配穴电针组乳酸含量增加(p<0.01);葡萄糖,丙氨酸,脯氨酸,丙酮酸含量显著减少(p<0.01)。与心肌缺血模型组相比,sirt1抑制剂组6种代谢物含量均下降,差异显著(p<0.01);sirt1抑制剂+标本配穴电针组与模型组相比,6种代谢物含量均下降,差异明显(p<0.01)。与sirt1抑制剂+标本配穴电针组相比,标本配穴电针组6种物质含量均显著增高(p<0.01);sirt1抑制剂组葡萄糖、乳酸、丙氨酸含量显著降低(p<0.01)。6.与正常组相比,心肌缺血模型组马尿酸含量明显增高(p<0.01);牛磺酸、辛酸、乙酰乙酸、n-乙酰谷氨酸、壬二酸、奥昔嘌醇、4-羟基苯乙酸、顺式乌头酸含量明显降低(p<0.01)。与模型组相比较,标本配穴电针组乙酰乙酸与奥昔嘌醇含量显著升高(p<0.01),牛磺酸、葡萄糖醛酸、辛酸、马尿酸、n-乙酰谷氨酸、壬二酸、4-羟基苯乙酸、顺式乌头酸、二甲胺和甘氨酰脯氨酸含量显著下降,差异具有统计学意义(p<0.01)。sirt1抑制剂组与模型组比较,奥昔嘌醇水平显著提高(p<0.01),n-乙酰谷氨酸含量稍有升高,差异不具有统计学意义,其余10种代谢物含量均显著降低(p<0.01)。sirt1抑制剂+标本配穴电针组与模型组比较,牛磺酸、壬二酸、奥昔嘌醇含量显著提高(p<0.01),其余9种代谢物含量显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01)。与sirt1抑制剂+标本配穴电针组相比,标本配穴针刺组牛磺酸、辛酸、二甲胺、奥昔嘌醇、壬二酸显著减少(p<0.01或p<0.05),马尿酸、乙酰乙酸、4-羟基苯乙酸、甘氨酰脯氨酸、顺式乌头酸显著增高(p<0.01或p<0.05);sirt1抑制剂组,牛磺酸、辛酸、乙酰乙酸、二甲胺、壬二酸、奥昔嘌醇含量显著降低(p<0.01),马尿酸、n-乙酰谷氨酸、顺式乌头酸含量明显增加(p<0.01)。结论1.标本配穴电针对心电活动、心肌功能、心肌酶指数与心肌形态学表达都有较好的促进作用,可有效恢复心肌正常功能,改善心肌组织缺血症状,修复心肌缺血损伤,在慢性心肌缺血中发挥了对心脏较好的保护与治疗作用。2.标本配穴针刺组与慢性心肌缺血组相比,代谢轮廓区分明显,血清代谢中有着特异的特征,乳酸含量显著增加,葡萄糖,丙氨酸,脯氨酸,丙酮酸含量显著降低。3.标本配穴电针组与慢性心肌缺血组相比,代谢轮廓区分明显,尿液代谢中有着特异的特征,乙酰乙酸、奥昔嘌醇含量显著升高,牛磺酸、葡萄糖醛酸、辛酸、马尿酸、n-乙酰谷氨酸、壬二酸、4-羟基苯乙酸、顺式乌头酸、二甲胺、甘氨酰脯氨酸含量显著下降。4.血清与尿液代谢中产生的以上代谢产物与能量代谢、脂代谢、糖代谢、氨基酸代谢相关,说明标本配穴电针治疗慢性心肌缺血可能是通过调节这些产物的表达来改善相关代谢紊乱实现的,这些代谢产物有望成为慢性心肌缺血临床预防、诊疗与评估疾病转归重要相关的代谢标志物。5.标本配穴电针治疗慢性心肌缺血也可能是通过激活srit1来改善线粒体相关代谢途径实现的,是否与srit1有关,又是通过何种途径进行调节,通过以后进一步的实验研究来验证。