论文部分内容阅读
卵巢癌是恶性程度最高的妇科肿瘤,缺乏早期诊断标志物、容易早期转移扩散以及耐受化疗药物是造成卵巢癌死亡-发病率(death-incidence ratio)高的重要因素。深入研究卵巢癌发生发展尤其是侵袭转移的分子机制,并由此制定有效的分子诊断方法与靶向治疗策略,对于提高卵巢癌的诊治水平并降低死亡率具有重要的理论和现实意义。NID1 (Nidogen-1)是我们在前期卵巢癌蛋白质组研究中筛选并验证的可辅助卵巢癌诊断的候选血浆蛋白标志物之一,它在卵巢癌患者血浆中的蛋白水平显著升高,与其它候选蛋白进行联合检测可进一步提高诊断灵敏性和特异性。另外,NID1在携带淋巴结转移的卵巢癌患者血浆和肿瘤组织中的水平均高于无淋巴结转移的卵巢癌患者。NID1作为细胞外基质特化结构——基膜的重要成分,它在卵巢癌发生发展中的作用并不清楚。结合文献调研(“肿瘤侵袭、EMT和基膜三者存在密切关联”)和前期临床数据(“卵巢癌样本中NID1的高表达与淋巴结转移相关”),我们推测NID1极可能在卵巢癌的侵袭转移过程中发挥重要作用。以此为据,本课题从以下四方面深入开展NID1对卵巢癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制的研究,以期为NID1作为候选的卵巢癌预后标志物和治疗靶标的研究价值提供科学依据。(1)稳定过表达NID1蛋白和瞬时敲降NID1蛋白的细胞模型的建立：采用NID1表达质粒转染OVCAR-3细胞并筛选稳定的单克隆细胞株(命名为OVCAR-3-NID1-MC细胞),采用两种NID1-siRNA分别瞬时转染HEY细胞获得HEY-NID1-si798细胞和HEY-NID1-si2983细胞。进一步采用荧光定量RT-PCR和Western blot鉴定这些细胞模型,确认OVCAR-3-NID1-MC细胞是稳定高表达NID1蛋白的细胞模型,而HEY-NID1-si798和]HEY-NID1-si2983细胞是瞬时敲降NID1蛋白的细胞模型。(2)NID1对卵巢癌细胞侵袭转移能力的影响：划痕实验显示OVCAR-3-NID1-MC细胞的侧向迁移速度明显快于对照细胞,Transwell侵袭转移实验显示OVCAR-3-NID1-MC细胞的转移能力和侵袭能力明显优于OVCAR-3-vector,表明过表达NID1增强卵巢癌细胞OVCAR-3的迁移和侵袭能力。同样地,Transwell侵袭转移实验显示,HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983细胞的转移能力和侵袭能力弱于对照细胞,表明敲降NID1减弱卵巢癌细胞HEY迁移和侵袭能力。(3)NID1对卵巢癌细胞EMT相关表型的影响：不同于对照细胞的“立方形”外形,OVCAR-3-NID1-MC细胞呈现出“梭形”外形。荧光定量RT-PCR和Western blot结果显示OVCAR-3-NID1-MC细胞的上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降,间质细胞标志分子(包括Vimentin和N-cadherin)和EMT相关转录因子Twist-2表达表达升高。细胞免疫荧光的再次证实了OVCAR-3-NID1-MC细胞中Vimentin荧光信号更强。与之相对应,HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983细胞与对照细胞的“梭形”相比更偏“立方形”外形,尽管Vimentin、N-cadherin和Twist-2并没有发生预料中的改变,但Western blot和细胞免疫荧光结果均显示两种瞬时敲降NID1的HEY细胞的E-cadherin表达都显著升高。以上结果表明,NID1促进卵巢癌细胞发生EMT。(4)NIDl通过ERK/MAPK通路改变EMT相关分子表达：Western blot结果显示,OVCAR-3-NID1-MC细胞中ERK1/2的磷酸化水平显著高于对照细胞。经ERK/MAPK通路的抑制剂U0126下调其ERK1/2的磷酸化水平后,E-cadherin、Vimenti、N-cadherin和Twist-2表达水平出现逆转。以上结果提示,NID1可通过ERK/MAPK通路改变卵巢癌细胞EMT相关分子的表达,促进细胞发生EMT。另外,Western blot结果显示OVCAR-3-NID1-MC细胞中粘着斑激酶FAK磷酸化水平(磷酸化位点为397位酪氨酸)水平升高,表明FAK处于活化状态,推测FAK可能是ERK/MAPK通路的上游调控蛋白。综上所述,本研究利用稳定过表达NID1蛋白和瞬时敲降NID1蛋白的细胞模型,首先发现NID1促进卵巢癌细胞的侵袭和转移,并同时伴随着EMT发生,从而证实了"NID 1通过EMT促进卵巢癌侵袭转移”这一学术猜想。然后,在稳定过表达NID1蛋白的细胞模型中,发现ERK/MAPK通路处于激活状态,并且经ERK/MAPK通路的抑制剂阻断该通路后,EMT相关蛋白的表达水平绝大多数都出现逆转,从而确定"NID1通过ERK/MAPK通路来促进卵巢癌细胞的EMT过程”这一分子机制。同样地,在稳定过表达NID1蛋白的细胞模型中,还发现FAK处于活化状态,提示NID1可能通过Integrin-FAK通路来激活ERK/MAPK通路,这一点仍需要更多实验数据的佐证。