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肝脏恶性肿瘤的治疗在经历手术、放疗、化疗之后，免疫基因治疗已经成为肿瘤治疗领域的热点，现在治疗的热点主要集中在以细胞因子为目的基因的免疫基因治疗。细胞因子在肝癌的抗肿瘤治疗中的作用已经是有目共睹的：细胞因子可作为恶性肿瘤生长的直接调节剂，杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞，通过作用于肿瘤的血管和营养供应系统影响宿主／肿瘤关系，激发宿主对肿瘤的免疫反应。目前应用细胞因子进行肿瘤免疫治疗的动物实验已经取得了非常显著的效果，已有越来越多的细胞因子治疗方式引入临床实践中，人们进行了在体外用IL-2诱生自体LAK细胞，然后回输到患者体内治疗恶性肿瘤的尝试，这一疗法在某些肿瘤患者取得了使肿瘤缩小的效果。但是，临床实验中发现，给人体反复应用重组IL-2可产生多种副作用。因而我们发现在肝癌肿瘤组织的局部持续地高浓度地给予细胞因子，能使细胞因子发挥最大的抗肿瘤效应，使其的副作用减到最小。目前，肝癌免疫基因治疗的研究结果尚不能令人满意，主要的原因是缺乏良好的基因转移载体。因而，选择一个良好的基因转移载体是实现肝癌免疫基因治疗的关键所在。近年来，随着干细胞研究的深入，发现干细胞具有自我更新和多潜能分化的双重特性，加之易于采集、回输，是基因治疗理想的靶细胞，从而出现了免疫基因治疗与干细胞治疗相结合的应用研究。将外源性基因导入干细胞的研究近年开始增多，其目的主要有：①促进干细胞分化：②作为基因治疗细胞载体；③干细胞基因修饰后增强某基因表达，对其进行功能改造以适应治疗的需要。肝干细胞较肝细胞有着更强的增殖能力，在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力，目前成为治疗肝脏疾病的理想载体细胞。本研究通过RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并将其克隆至PET-32a原核表达载体中，转化大肠杆菌BL-21。经IPTG诱导表达，产生融合蛋白。同时采用DNA重组技术，构建了重组逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，并研究其在包装细胞PT67中的表达。然后，通过逆转录病毒介导人白介素-2基因转染而建立稳定高效表达的肝干细胞WB-F344，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。第一部分人白细胞介素-2 cDNA的克隆及原核载体的构建及其表达目的：通过RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并构建重组原核表达载体PET-32a-IL-2，并在大肠杆菌BL21中表达。方法：分离健康人外周静脉血单核巨噬细胞，通过细胞总RNA的提取、RT-PCR从人体周围静脉血中扩增IL-2全长编码序列，并将其克隆至T载体中。测序，并利用DNAStar软件对所测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、分析。将IL-2全长编码序列克隆至PET-32a-IL-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL-21，经IPTG诱导表达，并经10％SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及Westen blot鉴定。结果：正确扩增出人IL-2全长编码序列，测序结果正确，并分析了人白介素-2的蛋白结构。正确构建了重组原核表达质粒PET-32a-IL-2，测序结果正确，并在大肠杆菌中高效表达。结论：扩增出的人IL-2和文献报道的cDNA序列一致，并构建重组原核表达质粒PET-32a-IL-2。第二部分携带人IL-2基因重组逆转录病毒载体的构建及其在PT67细胞中的包装目的：构建人白介素-2基因的逆转录病毒体系Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，并研究其在包装细胞PT67中的表达。方法：采用DNA重组技术，将pEGFP-N1质粒用EcoRI和NotI进行双酶切，获得EGFP cDNA片段，与用同样酶切的Plpcx载体在Ligation Mix连接酶的作用下进行连接反应，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-EGFP。酶切鉴定，测序证实。以PET-32a-IL-2为模板，通过PCR扩增IL-2全长编码序列，BamHI和EcoRI双酶切后将该片段克隆至Plpcx-EGFP，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-IL-2-EGFP，酶切鉴定，测序证实。采用DNA重组技术，将PET-32a-IL-2质粒用BglⅡ和NotⅠ进行双酶切，获得IL-2 cDNA片段，与用同样酶切的Plpcx载体在Ligation Mix连接酶的作用下进行连接反应，构建成重组逆转录病毒表达载体Plpcx-IL-2。酶切鉴定，测序证实。用Lipofectamine2000介导Plpcx-EGFP转染入逆转录病毒包装细胞PT67中，观察转染效率。用Lipofectamine 2000介导Plpcx-IL-2-EGFP和Plpcx-IL-2转染入逆转录病毒包装细胞PT67中，经嘌呤霉素筛选后，并用NIH3T3细胞测定病毒滴度，获得高滴度的抗性克隆，命名为PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2。结果：(1)构建的Plpcx-EGFP重组载体经酶切鉴定后有约6.3kb的载体片段和780bp的EGFP片段，构建的Plpcx-IL-2-EGFP重组载体经酶切鉴定后有780bp的EGFP片段，构建的Plpcx-IL-2重组载体经酶切鉴定后有462bp的IL-2片段，三种重组载体皆经测序进一步证实。(2)筛选PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2细胞抗性克隆，其病毒滴度达10~5CFU／ml。结论：成功构建了携带人IL-2基因的逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2，建立的逆转录病毒系统PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2能产生高滴度的病毒颗粒，为下一步感染肝干细胞WB-F344奠定了基础。第三部分稳定表达人白介素-2的肝干细胞系的建立目的：通过逆转录病毒介导人白介素-2基因转染而建立稳定高效表达的肝干细胞WB-F344。方法：(1)选用高滴度的PT67／Plpcx-IL-2-EGFP和PT67／Plpcx-IL-2病毒液进行肝干细胞WB-F344的感染，经嘌呤霉素筛选，获得抗性克隆，命名为WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2；(2)分别用基因组PCR、RT-PCR和Western blot、间接免疫荧光试验、细胞免疫组化检测WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2人白介素-2基因整合入细胞基因组及细胞内人白介素-2的表达的情况。结果：(1)嘌呤霉素筛选WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2细胞抗性克隆生长良好。(2)Western blot检测的WB-F344／Plpcx-IL-2细胞可见有15kD的特异条带，证明有白介素-2的表达；基因组PCR和RT-PCR均显示有与预期结果一致的462bp的条带，证实WB-F344／Plpcx-IL-2细胞有IL-2基因整合及mRNA表达。间接免疫荧光试验、细胞免疫组化均证实人IL-2蛋白在WB-F344／Pipcx-IL-2细胞中的表达。结论：构建能稳定表达人白介素-2的肝干细胞系WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。结论：1．正确扩增出人IL-2全长编码序列，测序，并利用DNAStar软件对所测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析。2．正确构建了重组原核表达质粒PET-32a-IL-2，测序结果正确，并在大肠杆菌中高效表达了融合蛋白。3．成功构建了携带人IL-2基因的逆转录病毒载体Plpcx-EGFP、Plpcx-IL-2-EGFP及Plpcx-IL-2。4．建立的逆转录病毒系统PT67／Plpcx-IL-2-EGFP及PT67／Plpcx-IL-2能产生具有感染性的病毒颗粒。5．成功构建能稳定表达人白介素-2的肝干细胞WB-F344／Plpcx-IL-2-EGFP和WB-F344／Plpcx-IL-2，为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗的动物实验打下基础。