论文部分内容阅读
背景和目的肿瘤的生存和进展依赖于肿瘤微环境,其中具有独立杀伤能力的NK细胞是肿瘤免疫的第一道防线,而肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）也参与了这一免疫过程。研究表明,IL-6通过对JAK、Stat3等多种细胞因子的调控,广泛参与前列腺癌的侵袭进展过程,作为JAK/Stat3的下游调控因子PD-L1通过靶向调控T细胞功能,在肿瘤免疫方面发挥重要作用,而三者联合在激素非依赖性前列腺癌（CRPC）对NK细胞免疫逃逸方面尚未有相关研究。本课题以此为思路,结合TAM的募集,观察IL-6通过调控JAK1、2/Stat3-PD-L1信号通路影响NK细胞对CRPC的免疫杀伤能力,旨在探寻增强NK细胞对CRPC免疫杀伤的有效途径,为CRPC的靶向免疫治疗提供新的思路。方法1.以CRPC细胞株C4-2、CWR22Rv1为研究对象,慢病毒转染法建立IL-6敲除细胞株siIL-6及对照细胞株sc,观察IL-6对肿瘤细胞募集TAM能力的影响。筛选TAM募集显著相关的细胞因子,加入相应的抗体,观察其对CRPC细胞募集TAM能力的影响。2.肿瘤细胞与TAM培养液共培养,检测共培养后肿瘤细胞IL-6、PD-L1的表达以及NK细胞活化受体NKG2D配体的表达,观察肿瘤细胞对NK细胞募集能力的变化;加入IL-6抗体观察肿瘤细胞PD-L1及NKG2D配体的表达变化。3.将TAM培养液分别与肿瘤细胞、NK细胞共培养或三细胞共培养,行NK细胞介导的细胞毒实验;分别加入IL-6抗体,观察其对NK细胞免疫杀伤能力的影响。肿瘤细胞与TAM培养液共培养后与NK细胞共培养,行单细胞克隆实验,从细胞存活角度反应NK细胞杀伤能力的变化。4.肿瘤细胞与TAM培养液共培养,筛选IL-6下游显著调控PD-L1的细胞因子。肿瘤细胞与TAM培养液共培养,行NK细胞介导的细胞毒实验,同时加入相应的抑制剂或与PD-L1抗体联合应用,观察其对NK细胞免疫杀伤肿瘤细胞能力的影响。5、利用C4-2sc及C4-2siIL-6细胞株建立去势的CRPC原位移植瘤模型,每周行小动物活体成像系统（IVIS）检测肿瘤成瘤及生长情况,于建模后第二周通过尾静脉注射荧光素酶标记的TAM,48小时后观察肿瘤募集TAM能力的差异,取肿瘤组织检测IL-6、CD68、F4/80、CCL2、CCL5的表达。6.同样方法建立去势的CRPC原位移植瘤模型,于第4天及第7天分别通过尾静脉注射人原代NK细胞。于第48天处死裸鼠,取肿瘤组织称重,观察抑制IL-6表达对NK细胞免疫杀伤肿瘤能力的影响。结果1.siIL-6细胞株可明显降低CRPC募集TAM的能力,并可显著抑制募集相关细胞因子CCL2、CCL5;分别及联合加入CCL2、CCL5抗体,可显著降低肿瘤细胞募集TAM的能力。2.肿瘤细胞与TAM培养液共培养,肿瘤细胞IL-6、PD-L1的表达增高,而NKG2D配体的表达降低,加入IL-6抗体可有效逆转这一效应。3.TAM培养液分别与肿瘤细胞、NK细胞共培养或三细胞共培养,NK细胞介导的毒力实验均提示NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力下降,且三者共培养方式下降最为显著。加入IL-6抗体,可有效增强NK细胞对CRPC细胞的免疫杀伤能力。4.TAM培养液与肿瘤细胞共培养,IL-6下游JAK1、JAK2、Stat3表达明显升高,而抑制JAK1、JAK2及Stat3可显著降低肿瘤细胞PD-L1的表达;提示IL-6-JAK1、2/Stat3-PD-L1构成上下游调控关系。联合抑制JAK1、2/PD-L1较单一抑制可更好的增强NK细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤能力。5.动物实验结果显示,抑制IL-6表达可显著降低CRPC募集TAM的能力,肿瘤组织中IL-6、TAM标志物CD68、F4/80及TAM募集相关标志物CCL2、CCL5的表达下降,抑制IL-6表达可有效增强NK细胞对肿瘤免疫杀伤能力,从而抑制了肿瘤的生长。结论1.抑制IL-6表达可有效抑制CRPC细胞对TAM的募集,它是通过下调CCL2、CCL5来实现这一调控效应的,较单一抑制,联合抑制CCL2、CCL5可更显著的抑制CRPC细胞对TAM的募集。2.TAM通过旁分泌作用于CRPC细胞及NK细胞,通过上调IL-6、PD-L1、下调NKG2D配体在CRPC细胞中的表达,从而抑制NK细胞对CRPC细胞的免疫杀伤,而加入IL-6抗体可显著逆转这一效应。3.IL-6-JAK1、2/Stat3-PD-L1信号通路构成了上下游调控关系,导致了CRPC细胞对NK细胞的免疫逃逸。相对单一抑制该信号通路,联合抑制JAK1、2/PD-L1可更好的增强NK细胞对CRPC细胞的免疫杀伤能力。4.动物实验验证了抑制IL-6可减少CRPC募集TAM,增强NK细胞对CRPC的免疫杀伤能力,抑制了肿瘤的生长。