论文部分内容阅读
枣树原产于中国,栽培历史悠久,适生范围广,有700余个品种。由植原体侵染引起的枣疯病是我国许多枣产区枣树上的毁灭性病害,严重影响红枣产业的发展和农民的致富。已知不同的枣树品种对枣疯病的抗性存在明显差异,且不同的品种分布区域各异。为了明确引起枣疯病的病原的种类和变异,更好地利用抗病资源,从根本上解决病害防治问题,本研究对全国各地感染不同枣树品种的枣疯病植原体进行了分子鉴定和变异分析。为了检测不同地区的不同枣树品种上的枣疯植原体的侵染及其保守基因序列的变异,本研究利用植原体16S rDNA的通用引物R16mF2/R16mR1、16S-23S间区序列（SR）的通用引物SR1/SR及分泌蛋白（secY）基因引物FD9f/r,首先通过PCR检测了采自国内7个地区14个枣树品种上的32个枣疯病和4个酸枣丛枝病样品。然后将PCR产物进行直接或克隆测序,结合已报导的测序数据,进行序列同源性和系统进化分析。结果显示,在所有枣疯病样品中均通过PCR检测到植原体的存在;序列同源性分析结果显示,它们皆属于16SrV-B亚组,与我国发生的重阳木丛枝和樱桃致死黄化植原体的遗传关系更近,而与其他国家发生的榆树黄化组的其他植原体遗传关系较远。不同地区和不同抗性品种枣树上的植原体间在16SrDNA、SR和secY基因都存在程度不同的序列差异及可能的遗传多样性群体;在混合的群体中,用PCR产物直接测序法检出的优势株系分布范围很广。不同株系间的secY基因核苷酸序列变异比16SrDNA和SR更明显,secY基因中某些碱基替换并不影响编码氨基酸的种类,但发现在一个山东和一个北京株系出现了碱基的缺失,可能会导致secY基因结构与功能的改变。与PCR产物直接测序法相比,用PCR产物克隆后测序结果能检测到更多的碱基突变,对于鉴别不同植原体株系及研究其系统发育关系更为有用。另外,克隆并测定的2株枣疯植原体的蛋白延伸因子（tuf）基因和1株的23SrDNA序列特征也与上述保守基因鉴定结果相吻合。胸苷酸激酶,催化磷酰基从ATP转移到dTMP形成dTDP,是DNA合成及修复过程中的重要酶。采用PCR产物克隆测序和PCR产物直接测序法,从枣疯病植原体各地区不同品种的感病组织中检测到了植原体的3种胸苷酸激酶基因tmka、tmkb和tmk（cTMK gene）,tmka和tmkb二者在不同地区的不同品种枣疯样品中的分别表现为tmka优势（AA）、tmkb优势（BB）、tmka和tmkb杂合（AB）三种状态。在全部34个供试样品中,AA型株系数量为11个,占32.3%,分布在北京、河北赞皇、山西稷山、山东宁阳和天津;BB型株系数量为4个,占11.7%,分布在河北唐县、行唐、阜平及河南南阳;AB型株系数量为19个,占55.9%,分布在北京宣武和海淀、河北唐县、平山、行唐和阜平、河南濮阳和洛阳、山西稷山和永济及江西吉安;tmkc基因仅在北京龙枣疯株系中克隆到,在其它株系中还未得到。AA型株系似乎与感病品种有关,而AB型则可能与抗病品种有关联。各植原体株系tmk基因全长基因PCR-RFLP、部分DNA片段的SSCP分析及特异性引物的选择性PCR扩增结果验证了上述大部分测序鉴定结果。不同地区和品种之间的tmk基因型的不同可能与枣树品种和栽培环境的差异及不同基因型的植原体株系随种苗的调运而导致基因的变异与重组有关。Tmka和tmkb长度均为639bp,编码212个氨基酸,核苷酸具有较强的AT偏好性。二者之间存在14个碱基差异,皆发生在第303-369位之间的67bp的可变区域,导致5处氨基酸变异;二者之间核苷酸序列相似性为97.8%,氨基酸序列相似性为97.6%。克隆的tmkc长度为654bp,它与tmka和tmkb基因的序列相似性分别为59.8%和59.5%。预测的编码蛋白TMKa、TMKb及TMKc与其他生物一样都含有3个非常保守的蛋白质功能位点,即ATP结合位点、NMP结合位点及LID。3种TMK蛋白的二级结构均以螺旋和卷曲为主,无二硫键的形成,是无跨膜区和信号肽的亲水性蛋白,定位在细胞质中;其等电点分别为TMKa/TMKb/TMKc:10.075/9.965/9.765。将枣疯植原体在内的34种植原体的tmk基因和另外29种其它物种的tmk基因进行系统进化分析,结果显示枣疯植原体tmka和tmkb基因皆归为第I大类,与洋葱黄化W株系的tmk-a（AB010446）关系最近,枣疯植原体tmkc基因与洋葱黄化植原体全基因组中的tmk2（AP006628,391588…392202）和翠菊黄化植原体全基因组中的tmk（3NC007716, 203228…203860）遗传关系最近,与第II和III类tmk基因遗传距离较远。