黄瓜花叶病毒(CMV)2b基因是其基因组中抑制植物PTGS的因子，是CMV重要的致病基因之一。利用病原物基因介导对自身抗性来提高农作物对病毒的抗性，已是抗病毒育种的重要途径之一，但目前尚无CMV 2b基因应用于抗病毒育种的报道。基于植物PTGS的最新研究成果，针对CMV 2b基因构建表达载体并导入植物后，有望获得对CMV的抗性。为验证该设想，本研究建立了一步RT-PCR技术扩增体系，并利用该体系扩增和分析了国内几种蔬菜作物部分CMV分离物的2b基因序列同源性，选择特定分离物(CMV-BG)的全长2b基因，先利用PVX侵染性载体初步分析其正义和反义序列间的互作，再构建植物表达载体转化烟草和番茄，并研究转基因烟草抗CMV的表现，获得了抗CMV的转基因烟草植株。具体结果如下： 1 根据已报道的CMV 2b基因保守核苷酸序列设计引物，以来源于我国北京番茄的CMV分离物为扩增模板，不需经过繁杂的病毒RNA提取过程，建立了一步RT-PCR扩增技术体系。利用PVX比较了该方法和双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)的检测灵敏度，结果表明该方法的灵敏度比后者高20倍。该方法还可应用于对部分十字花科蔬菜作物田间病样TuMV的快速检测。针对病毒序列的保守区设计引物，利用该一步RT-PCR方法，能对不同植物RNA病毒或同一RNA病毒不同株系样品进行快速检测，并可进行大规模RNA病毒样品的分析。 2 利用一步RT-PCR扩增体系，对国内9个不同寄主(主要是蔬菜作物)和不同地理来源的CMV分离物的2b基因片段进行了扩增，获得各个分离物含该基因全长约90％的cDNA片段(300bp)。将各个cDNA片段分别克隆到pMD18-T载体中，7个分离物的序列测定与分析表明，国内不同CMV分离物2b基因片段序列保守性较高：核酸序列同源性达93％以上，推测的氨基酸序列同源性超过90％，且这些分离物均属于亚组Ⅰ类型。因此，可利用其中任意一个分离物(如CMV-BG)的2b基因构建表达载体，以研究2b基因抗CMV的能力。 3 在进行2b基因导入植物稳定表达时是否具有CMV抗性研究之前，利用PVX表达载体(pSfinx)，快速地初步探讨了正义和反义2b基因间的相互作用。在获得北京甘蓝CMV分离物(CMV一BG)全长Zb基因的基础上，构建了其正义和反义的PVX侵染性载体pVXZbS和pVXZbAS。二者同psfinx表达载体本身一样，可侵染本氏烟、SRI和Samsun NN烟草，以及Shepody马铃薯和中蔬5号番茄，但均表现了不同程度的症状延迟。在22℃/16℃(昼/夜温度)条件下，二者分别接种SRI烟草均表现了一定的侵染稳定性(存在时间超过45天)，因此，可通过农杆菌菌液混合及交互接种研究正义和反义Zb基因间的相互作用。pvxZbs和pvXZbAS菌液混合接种后15天，只能检测到正义或反义一种载体的表达，且是随机的;二者交互接种时，后接种的一方不能表达。在排除psfinx载体自身的干扰因素外，初步认为正义和反义Zb基因间存在着干扰作用。 4本研究成功地构建了全长Zb基因的正义和反义植物表达载体pZM6.1和pZM6.2。采用农杆菌侵染的叶盘转化法，分别获得了转正义和反义Zb基因的SRI烟草和红玛瑙213番茄的卡那霉素抗性苗，并通过PCR检测，获得了一批PCR阳性转化株(转正义和反义Zb基因的SRI烟草PCR阳性株率分别为35%和46%;而转基因番茄只分别得到相应的3株和5株PCR阳性株)。对转基因烟草SRI的PCR阳性植株进行进一步的PCR一Southern杂交、斑点杂交、Southern杂交和一步RT一PCR等分子检测，表明正义和反义全长Zb基因已被分别整合到不同SRI烟草植株的基因组中，并且在转录水平获得了表达。以CMV一BG进行攻毒试验，发现正义和反义全长Zb基因的转基因烟草植株，均具有感病(与未转基因植株相似，植株生长延缓，症状严重至部分叶片畸形)、延迟抗病(接种3一4周后出现轻度花叶)和抗病(接种4周或更长时间后仍没有表现花叶症状)三种类型。通过抗病性鉴定，初步得到了抗CMV的转正义和反义Zb基因的烟草植株各1株。