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基因芯片技术具有高速度、高效率、高通量的特点,为临床生物的检测提供了良好的应用前景。目前通用的基因芯片技术有多种,但分别都存在着或者灵敏度不高,或者检测技术复杂,或者条件和设备要求高的问题限制了该技术在临床检测中的应用。本研究采用我室新研制出的纳米放大基因芯片检测的专利技术,并在前期课题的基础上,进一步优化研究纳米金新型基因芯片检测系统,从而实现芯片技术和纳米技术的更有机结合,以充分利用纳米金与银反应可将信号放大106倍的优势取代目前通用的荧光、同位素、酶标等信号报告材料,使之具有设备简单,技术稳定易于掌握,灵敏度高,应用范围广等特点,达到使基因芯片的检测技术能够用于普通实验室甚至野战条件等复杂环境的目的。在此基础上,进一步针对基因芯片检测样品的制备技术,分别结合核糖体分型技术及限制性差异显示技术,研制通用引物一次PCR法及限制性酶切非PCR法,以分别构建针对临床常见致病性细菌及包含非细菌的支原体、衣原体、真菌、病毒等检测的两种实用型纳米金基因芯片,从而为临床致病性病原微生物的快速、简便、准确诊断探索一条新的途径。试验主要方法及结果如下:第一部分 纳米金新型基因芯片系统的优化研究1. 引物巯基修饰后必须经过预还原处理,才能获得较好的PCR扩增效果,还原后的引物既不影响PCR的扩增效率和特异性,也不改变PCR扩增的条件。2. 标记优化试验表明:通过适当增加纳米金-核酸标记反应两组分比例的方法能够减少标记时间;轻微振荡虽然对最终标记效率增加不显著(p>0.05);但可以明显加快标记反应的速度,缩短标记达到最大标记效率的时间(大约为4小时)。3. 芯片杂交反应动力学的优化试验表明:探针浓度为500nM,杂交反应盐离子浓度为0.8M,杂交温度为45℃,杂交反应时间为8小时,最后经过严格条件漂洗可以获得最佳的杂交效率;而轻微的旋转振荡则可以进一步显著增加杂交的效率,包括显著减少杂交达到平衡的时间(大约为4小时)和显著增加最终的杂交强度(p<0.01)。4. 银染显色反应优化试验表明:进一步提高显色反应的温度,可以加快显色反应<WP=13>的速度,减少反应的时间和次数;37℃,3min×3的反应方式,就可以获得较好的显色效果。5. 质控基因的验证试验:植物基因质粒经Nco I/EcoR I、Nco I/Hind III及Nco I酶切鉴定表明其产生片段的数目及大小符合实验设计要求;对阳性质控片段的 PCR实验也显示其扩增产生的片段大小及特异性符合实验设计要求。表明质控基因及阳性质控片段是可靠的。6. 对芯片基本参数的评测结果表明:优化后的芯片系统具有较好的灵敏度(96.7%)、特异度(100%)及可靠性(95%)。特别是其检测敏感性可达到50fM,基本上是荧光标记的100倍(通常为5pM或更高),比优化前的第一代芯片系统(100fM)也提高了一倍左右。7. 临床样本检测实验表明:与常规经典检测鉴定方法比,芯片检测方法简单快捷,且检测结果裸眼清晰可见,背景低;两者的检测结果基本一致(符合率为94%);进一步的确证实验表明芯片检测的准确率为98%,高于临床常规经典检测的96%。以上实验结果显示该芯片检测技术灵敏度高,特异性好,不需要特殊设备,操作方法简单,所设计的检测内容达到实用化的水平,具有较好的临床应用前景。第二部分 纳米金新型基因芯片检测系统结合通用引物一次PCR法检测病原性细菌的研究1. 利用Primer Premier 5.0软件,针对16S rDNA 3’端及23S rDNA 5’端的最保守序列,设计完成了能够适用于枯草芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、百日咳鲍特氏菌、醋酸钙不动杆菌、淋病奈瑟氏菌、洋葱假单胞菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎链球菌、洛菲氏不动杆菌、奇异变形杆菌等12种靶细菌16S-23S rDNA区间(ISR)一次PCR扩增的通用引物;并在筛选确定的退火温度为56.8℃、镁离子浓度为2mM的最优条件下,利用该通用引物一次PCR完成了对所有靶细菌ISR序列的顺利扩增,且其检测的最低敏感性仅为3CFU;实验同时表明该通用引物具有较好的特异性、重复性。2. 在相同条件下利用Array Designer 2.0软件设计了针对各靶细菌ISR的特异性寡核苷酸探针;生物标记筛选实验结果表明所选用探针特异性强、可靠性好;且探针间Tm值相差仅0.5℃,基本上具有相同的杂交条件,能满足芯片多重杂交的要求。3. 芯片基本参数的检测表明该芯片也具有较好的灵敏度(95%)、特异性(97.9%)及可靠性(100%);检测敏感性同样可以达到50fM。 <WP=14>4. 对临床19例样本的检测结果显示,该芯片与临床常规检定方法以及第一部分构建的纳米金芯片的检测结果具有较好的准确性和一致性,符合率达100%。以上结果表明本芯片检测方法准确可靠,可用于各靶细菌的检测;而且与第一部分的多重PCR样品制备法芯片比较,其检测的步骤和复杂性明显大大减低,更易体现芯片的高速度、高效率特点,显然更具有临床实用价值。第三部分 纳米金新型基因芯片检测系统结合限制性酶切非PCR法检测病原性微生物的研究1. 病毒、支原体等病原体一直是临床检测的弱点和难点。据此本部分实验选择确定幽门螺杆菌、肺炎支原体、沙眼衣原体、白色念珠菌、解脲脲原体、EB病毒作为实验目标,其涵盖了病毒、衣原体、支原体及真菌、细菌等五大类;并试验确?