目的:　　 疟疾是疟原虫通过媒介按蚊传播的人类最为严重的寄生原虫感染性疾病，2003年世界卫生组织(WHO)已将疟疾作为优先重点防治的感染性疾病。《世界疟疾报告2012》公布的最新数据显示，目前全球有2.19亿疟疾病例，2010年因疟疾死亡的人数为66万，104个国家和地区有疟疾流行的报告。我国也制定了“十二五”期间在中国境内消灭疟疾的宏伟计划。因此，抗疟研究已经成为当今世界迫切需要解决的重点课题。疟疾与其他大多数感染性疾病一样，需要通过免疫效应机制对其控制和消除，免疫应答的时效与强度影响宿主感染疟原虫的感染模式与结局。大量的研究数据显示，在疟疾流行区，混合感染现象普遍存在，从而影响宿主的感染模式和结局。较常见的有疟原虫与HIV、蠕虫或结核分枝杆菌的混合感染。因此，探讨疟疾流行区病原体之间的相互作用特点，特别是病原体对疟疾免疫应答的影响及其相关机制无疑将为揭示疟疾流行区病原体相互作用的细胞和分子机制提供新的理论依据，进一步充实对疟疾免疫的认识。　　 本研究用旋毛形线虫小鼠模型再感染疟原虫，动态观察旋毛形线虫混合感染对疟疾感染进程与最终结果的影响，并着重探讨T细胞在感染过程中的变化以及这些变化对宿主免疫力和预后的影响，旨在进一步揭示旋毛形线虫与疟原虫共同感染的相关细胞和分子机制，以期为疟疾流行区新的防控策略的确定提供新的思路。　　 方法:　　 1、实验动物及其模型建立　　 54只雄性BALB/c小鼠随机分为3组，每组18只。实验组小鼠(TPC)经口感染300只旋毛形线虫，并于感染后的1w(TPC1)、3w(TPC3)经腹腔感染1×106夏氏疟原虫寄生的红细胞，构建混合感染模型。对照组(PC)在同一时间点单纯感染夏氏疟原虫。　　 2、原虫血症检测及体重观察　　 混合感染模型制备成功后，每天随机取3只小鼠，经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，显徼镜检计数红细胞感染率并记录小鼠体重变化。　　 3、脾细胞荧光抗体染色　　 无菌取出感染前(0d)和感染后5d、10d、15d小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1mL，每份样品加入抗-CD4-FITC单抗进行表面染色，另设阴性对照管。固定透膜后，用抗-IFN-γ-PE单抗、抗-Gata-3-PE单抗进行胞内染色。用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μl PBS中，流式细胞仪(BectonDickinson，USA)进行检测。每份样品用抗-CD4-FITC和抗-CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗-Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1％FCS的PBS洗涤两次并悬浮于500μl PBS中，流式细胞仪进行检测。　　 4、IFN-γ、IL-4及IL-10定量检测　　 用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ IL-4及IL-10的分泌水平。操作过程按照试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定450nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoflMax Pro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 5、血清特异性抗体检测　　 于感染前(0d)和感染后5d、10d、15d采集小鼠眼球血于1.5 ml离心管中，收集疟原虫并制备抗原包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，5％FCS封闭1h，洗涤后加入1∶200稀释的血清，37℃2h。洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶500)100μl/孔，37℃1h，洗涤。然后加入OPD-H2O2底物显色，15 min，2M H2SO4终止反应，用酶标仪测定波长490nm处的OD值。　　 6、转录因子分析　　 (1) RNA提取及cDNA合成　　 采用Trizol一步法提取脾细胞总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的含量。用Takara逆转录试剂盒进行反转录，反转录为cDNA后，置-20℃保存。　　 (2)引物设计　　 通过Primer5.0在线软件设计Gata-3，T-bet以及GAPDH实时定量PCR引物序列。　　 (3)荧光定量PCR检测T-bet及Gata-3 mRNA表达水平　　 利用SYBR GreenⅡ染料进行各基因的实时荧光定量PCR检测，反应体系20μL，共40个循环。为消除样本处理、反转录反应差异，每个样品GAPDH、Gata-3及T-bet基因同时检测3次，取平均值。　　 7、统计学分析　　 使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t-检验比较分析组内和组间均值差异。P小于0.05为差异显著。　　 结果:　　 1、混合感染模型的鉴定　　 旋毛形线虫感染8w后将全部小鼠引颈处死，取一小块膈肌压片镜检观察，证实小鼠均成功感染旋毛形线虫。　　 2、原虫血症检测及体重观察　　 与PC组相比，TPC1组感染后第3d，小鼠的外周血中出现疟原虫感染的红细胞。随后，BALB/c小鼠原虫血症迅速上升，至感染后9d达到峰值后迅速下降，PC组峰值为40.15％，TPC1组为33.4％（峰值降低）。TPC3组于感染后第5d检测出原虫血症，原虫血症出现时间推迟，至感染后13d达到峰值44.55％（峰值升高），TPC组与PC组均与感染后21d左右自愈。TPC组与PC组相比体重均下降。　　 3、旋毛形线虫与鼠疟原虫共同感染小鼠脾细胞悬液细胞数量检测　　 (1) CD4+IFN-γ+T细胞数量检测　　 与感染前相比，感染后第5d、10d，PC组小鼠CD4+IFN-γ+T细胞均出现明显增加。TPC1组小鼠于感染后第5d，CD4+IFN-γ+T细胞数量显著高于PC组小鼠。然而，TPC3组与PC组相比无统计学差异。　　 (2) CD4+Gata-3+T细胞数量检测　　 与感染前相比，感染后第10d，PC组小鼠CD4+Gata-3+T细胞出现明显增加。TPC3组小鼠于感染后第10d，CD4+Gata-3+T细胞数量显著高于PC组小鼠。然而，TPC1组与PC组相比无统计学差异。　　 (3) CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量检测　　 与感染前相比，感染后第5d、10d，PC组小鼠Treg细胞出现明显增加。TPC1组小鼠于感染前及感染后第5d，Treg细胞数量显著低于PC组小鼠。然而，TPC3组与PC组相比无统计学差异。　　 4、旋毛形线虫与鼠疟原虫共同感染小鼠脾细胞培养上清中细胞因子检测　　 (1)IFN-γ水平检测　　 与感染前相比，感染后第5d，PC组小鼠脾细胞IFN-γ分泌出现明显增加。TPC1组小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平显著高于PC组小鼠。然而，TPC3组小鼠于感染后第5d，IFN-γ分泌水平显著低于PC组小鼠。　　 (2)IL-4水平检测　　 与感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC组小鼠脾细胞IL-4分泌出现明显增加。TPC3组小鼠于感染后第5d、10d，IL-4分泌水平显著高于PC组。然而，TPC1组与PC组相比无统计学差异。　　 (3)IL-10水平检测　　 与感染前相比，感染后第5d、10d、15d，PC组小鼠脾细胞IL-10分泌出现明显增加。 TPC1组小鼠于感染后第5d，IL-10分泌水平显著低于PC组。然而，TPC3组与PC组相比无统计学差异。　　 5、小鼠血清IgG水平检测　　 与感染前相比，感染后第10d、15d，PC组小鼠血清中的特异性IgG出现了有意义的升高。 TPC3组小鼠于感染前及感染后第5d，IgG表达水平显著高于PC组。然而，TPC1组与PC组相比无统计学差异。　　 6、旋毛形线虫与鼠疟原虫共同感染小鼠脾细胞悬液中转录因子检测　　 (1) T-bet水平检测　　 与感染前相比，感染后第5d、15d，PC组小鼠T-bet表达出现明显增加。TPC1组小鼠于感染后第5d，T-bet表达水平显著高于PC组。然而，TPC3组与PC组相比无统计学差异。　　 (2) Gata-3水平检测　　 与感染前相比，感染后第5d，PC组小鼠Gata-3表达出现明显增加。TPC3组小鼠于感染后第5d，Gata-3表达水平显著高于PC组。然而，TPC1组与PC组相比无统计学差异。　　 (3) T-bet与Gata-3表达水平的比值　　 与感染前相比，PC组小鼠于感染后第5d，T-bet/Gata-3比值达到峰值，于感染后第10d迅速下降至最低点，随后于感染后第15d再次升高。TPC1组小鼠T-bet/Gata-3比值显著高于PC组。然而，TPC3组小鼠T-bet/Gata-3比值显著低于PC组。　　 结论:　　 1、不同时相旋毛形线虫与夏氏疟原虫共同感染BALB/c小鼠，其免疫应答模式存在差异。　　 2、不同时相旋毛形线虫混合感染改变宿主对疟原虫的抗感染能力，但混合感染并不影响宿主最终清除疟原虫的能力。