论文部分内容阅读
[目的]黑色素在保护皮肤免受紫外线辐射和各种环境污染物的氧化应激方面发挥着巨大的作用。然而黑色素的过度生成与累积会造成严重的皮肤色素沉着,这也是化妆品公司常年的研究热点之一。目前用于皮肤美白的产品种类繁多,但均有一定的局限性和副作用。因此,开发新型有效的抑制黑色素合成的天然美白剂至关重要。两栖动物分泌物中含有丰富的天然活性多肽,课题组前期从云南臭蛙（Odorrana andersonii）皮肤分泌物中分离并鉴定出了 一种多肽OA-VI12（VIPFLACRPLGL）,发现其具有显著的抗氧化能力与抗皮肤光损伤活性。本次研究中,我们对OA-VI12抑制黑色素合成功能进行验证,并探究其可能的分子调控机制。研究结果有望为医疗、化妆品行业提供新的肽类先导分子。[方法]将OA-VI12与酪氨酸酶（Tyrosinase,TYR）进行模拟分子对接,探究OA-VI12与TYR的相互作用方式与结合构型。建立体外TYR与L-多巴（L-dopa）反应体系,测定OA-VI12对TYR的抑制活性;MTS法检测OA-VI12对小鼠黑色素瘤细胞（B16 cell）的增殖活性影响,裂解细胞后,通过分光光度计测量吸光度值检测OA-VI12对B16细胞TYR活性和黑色素含量的影响;建立紫外线B（Ultraviolet B,UVB）诱导的C57B/6小鼠耳皮黑色素沉着模型,通过病理切片染色检测OA-VI12抑制黑色素合成的作用;使用FITC荧光标记的OA-VI12对C57B/6小鼠耳朵进行涂抹处理,检测多肽的皮肤穿透效果;并对小鼠耳朵组织进行小RNA测序（small RNA）,通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、双荧光素酶报告基因实验、免疫荧光实验与蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）,进一步探究OA-VI12抑制黑色素生成的分子调控机制。[结果]1.OA-VI12与TYR存在多个互相作用的残基与氢键链接,总自由结合能为-53.193 kJ/mol。2.OA-VI12具有直接抑制TYR的活性,IC50值为36.77 μM。3.OA-VI12对B16细胞无明显促增殖/抑制活性,但可有效抑制B16细胞中TYR活性,并降低黑色素含量。4.OA-VI12有效抑制UVB诱导的小鼠（C57B/6）耳皮黑色素沉着。5.OA-VI12可在2h内透过小鼠（C57B/6）耳朵的表皮层与真皮层。6.小RNA测序（small RNA）结果发现,模型组较空白对照组共有62个差异表达MicroRNA（miRNA）,OA-VI12处理组较模型组共有50个差异表达miRNA,取交集后共有26个差异表达miRNA;其中25个miRNA在造模后上调,OA-VI12处理后下调,1个miRNA（mmu-miRNA-122-5p）在造模后下调,OA-VI12处理后上调。KEGG通路富集分析发现,mmu-miRNA-122-5p可能在黑色素合成通路中发挥调控作用。7.RT-qPCR结果显示,C57B/6小鼠耳朵经UVB照射后,miR-122-5p表达明显下调,在OA-VI12处理后表达显著上调。B16细胞经OA-VI12处理后miR-122-5p表达显著上调;通过miNRA靶基因预测与双荧光素酶报告基因实验证明,mi-122-5p与MITF存在靶向调控关系。8.RT-qPCR和Western Blot结果显示,C57B/6小鼠耳朵在UVB照射后,MITF与TYR表达明显上调,在OA-VI12处理后表达显著下调。B16细胞经OA-VI12处理后,MITF与TYR的表达水平下调。免疫荧光实验发现,OA-VI12处理后MITF与TYR在B16细胞内的表达水平明显降低。[结论]OA-VI12直接抑制TYR的活性,且在B16细胞中显著降低TYR活性与黑色素含量;在UVB诱导的C57B/6小鼠耳皮黑色素沉着模型中发挥美白作用。其调控机制可能是通过上调miRNA-122-5p靶向抑制MITF/TYR分子轴抑制黑色素合成。本次研究首次报道了两栖动物源性多肽在皮肤美白方面的功能,并对其可能的调控机制进行探索,为OA-VI12多肽成为皮肤美白新型候选药物提供一定的理论基础,并为黑色素合成的调控机制研究提供新的miRNA线索。