系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种严重累及肾、肝、肺、心脏等多脏器且伴随终生的系统性自身免疫病,其病理特征表现为T、B细胞等免疫细胞异常活化,产生大量自身抗体并与自身抗原形成免疫复合物沉积在组织器官,导致慢性、全身性的炎症损伤。尽管SLE的病理机制仍不十分清楚,但大量研究表明,其发病原因可能与遗传因素、环境因素以及激素水平等有关。这些因素一方面引起凋亡缺陷等固有免疫异常,另一方面免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突细胞和巨噬细胞等)及其产生的细胞活性物质的异常改变,也加剧了适应性免疫的紊乱,最终导致大量自身抗体产生、补体激活和组织损伤。由于其发病机制的复杂性,SLE的临床治疗尚无特效药物,主要以缓解临床症状和免疫抑制为主,常用药有糖皮质激素、免疫抑制剂和一些生物药,这些药物长期应用会产生很多不良反应。因此,深入了解疾病的发病机制、发现特异性更高的SLE治疗靶点及创新药物,具有十分重要的临床意义。免疫球蛋白D(immuneglobulin D,Ig D)于1965年发现,是存在于人体体液中众多免疫球蛋白的其中一种,包括分泌型Ig D(secreted Ig D,s Ig D)和膜结合型Ig D(membrane Ig D,m Ig D)。s Ig D大多分布于人外周血、泪腺等体液中,m Ig D主要表达于B细胞表面。有研究表明,s Ig D与膜受体即Ig D受体(Ig D receptor,Ig DR)结合,可调节B细胞的稳态和活化来增强免疫保护,增强嗜碱性粒细胞的固有免疫反应,促进成熟B细胞的分化和生成,发挥重要的免疫调节作用。临床研究发现,自身免疫疾病中SLE患者、类风湿关节炎患者(rheumatoid arthritis,RA)、干燥综合症征(primary sjogren’s syndrome,p SS)部分患者的血液中s Ig D水平升高,在慢性炎症和B淋巴细胞瘤患者也可见s Ig D水平明显升高,提示s Ig D水平升高可能与这些疾病的发病具有相关性。Ig DR除了在T细胞、嗜碱性粒细胞上表达外,在RA患者滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)上也检测到Ig DR的表达。此外s Ig D可诱导CD4~+T细胞上Ig DR数量的增加,并且Ig D-Ig DR反应可促进同源T、B细胞相互作用和抗体的产生。实验室前期研究证明,Ig D可诱导RA患者和健康对照者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的增殖,增加T细胞活化的表面标志物CD69以及共刺激信号分子CD154(CD40L)的表达,增加外周血浆细胞(CD19~-CD138~+)的百分比、促进炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌,提示s Ig D可能在T、B细胞活化中发挥重要作用。Ig D-Fc-Ig融合蛋白(以下简称DG)是实验室以Ig DR为靶点、将人Ig D-Fc与人Ig G-Fc融合构建的融合蛋白(已获国家专利),可特异性阻断Ig D-Ig DR通路。课题组前期研究表明,DG可以抑制s Ig D诱导的T细胞增殖与活化,降低炎症细胞因子水平,具有较强的免疫调节与抗炎作用。为考察Ig D调节免疫功能参与SLE的病理机制以及DG对SLE的治疗作用,本研究以自发性狼疮模型MRL/lpr小鼠为对象,观察DG皮下注射给药对MRL/lpr小鼠狼疮样体征、免疫细胞亚群比例、脾脏肾脏病理等的作用,以进一步明确Ig D参与SLE发病的相关机制,为将DG开发成为治疗SLE创新药物提供实验依据。MRL/lpr小鼠是一种经典的狼疮样模型小鼠,表现为淋巴细胞大量增生,呈现明显的大淋巴结病伴有关节炎症、皮肤损伤等体征,自身抗体水平显著升高,肾脏呈狼疮性肾炎样病变,与人类SLE疾病特征极为相似。目的:研究Ig D调节免疫功能参与SLE发病的病理机制,明确DG对红斑狼疮样MRL/lpr小鼠的治疗作用并揭示其相关机制。方法:MRL/lpr小鼠随机分为模型组、DG组(2,4,8mg/kg)、强的松(prednisone,代号Pre,5mg/kg)组,另取BALB/c小鼠作为正常对照组,每组9只。DG组皮下注射给药,每周给药2次;Pre组每日灌胃给药;正常组与模型组动物皮下注射给予等容量生理盐水;所有动物给药时间均为6周,给药容量均为0.2ml/kg体重。每周观察并记录动物给药前后的毛发状态、行为活动等体征异常变化,用半定量尿蛋白试纸检测动物的尿蛋白变化,HE染色法检查动物的肾脏、脾脏病理改变,免疫组化法检测小鼠肾脏免疫复合物补体3(C3)的表达;处死动物后计算动物的脾脏和胸腺指数,BCA蛋白定量法检测小鼠尿液中的尿蛋白水平;CCK-8法检测LPS和Con A诱导的B和T淋巴细胞增殖反应;ELISA法检测小鼠血清中s Ig D、抗双链DNA抗体(anti-ds DNA)、肿瘤细胞坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和干扰素(IFN-γ)水平;流式细胞术检测脾脏T、B淋巴细胞亚群比例,包括:T细胞(CD3~+)、活化T细胞(CD4~+CD69~+)、幼稚T细胞(CD4~+CD62L~+)、TFH细胞(CD4~+CXCR5~+PD-1~+)、Th17细胞(CD4~+IL-17A~+)、Treg细胞(CD4~+CD25~+Foxp3~+)、表达共刺激分子配体T细胞(CD4~+CD154~+)、B细胞(CD19~+)、浆细胞(CD19~-CD138~+)、边缘区B细胞(CD19~+CD21~+CD23~-)、滤泡区B细胞(CD19~+CD21~-CD23~+)、成熟B细胞(CD19~+Ig D~+Ig M~-)、未成熟B细胞(CD19~+Ig D~-Ig M~+)百分比;q-PCR技术检测小鼠脾脏组织TFH细胞特异性转录因子Bcl-6和细胞因子IL-21m RNA;Western Blot方法检测小鼠肾脏组织的JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况。结果:1. DG给药可降低MRL/lpr小鼠的尿蛋白水平用半定量法定期检测小鼠给药后每周的尿蛋白水平,并且观察记录小鼠的毛发状态,行为活动进行评分。结果显示,在给药第4周始DG对MRL/lpr小鼠的尿蛋白、毛发状态、行为活动的作用与未给药组有显著性差异,并且最后对收集的尿液进行BCA定量,结果显示,DG(2,4,8mg/kg)能显著降低小鼠的尿蛋白水平。2. DG给药可改善MRL/lpr小鼠肾脏病理,减少肾脏免疫复合物C3的沉积肾脏病理结果显示,模型组小鼠肾脏的肾小球呈玻璃样变,系膜细胞增生并纤维化,肾小球及毛细血管周围有大量炎性细胞浸润,新月体形成;与模型组比较,DG(2,4,8mg/kg)给药可显著减轻肾小球炎性细胞浸润情况,抑制系膜细胞增生,改善炎症状态,明显改善肾小球纤维化和炎症病变。小鼠肾脏免疫复合物C3检测结果表明,模型小鼠C3表达水平明显升高,DG(2,4,8mg/kg)给药可显著降低肾脏C3补体的沉积。3. DG给药可降低MRL/lpr小鼠脾脏指数与胸腺指数,改善脾脏病理与正常组相比,肉眼可见MRL/lpr小鼠脾脏、胸腺体积显著增大,脾脏指数与胸腺指数也相应明显增大,DG(2,4,8mg/kg)给药后小鼠脾脏指数与胸腺指数均显著减小。病理学检查发现,模型小鼠脾脏滤泡增生,白髓弥漫性增生,生发中心数量增多,DG(2,4,8mg/kg)给药后脾脏体积较模型组有所减小,可明显改善脾脏病理。4. DG给药可抑制MRL/lpr小鼠胸腺T细胞、脾脏B细胞增殖CCK-8法检测小鼠T、B淋巴细胞增殖反应结果显示,模型小鼠T、B淋巴细胞增殖明显增强,DG(4,8mg/kg)给药可明显抑制Con A诱导的T细胞,DG(2,4,8mg/kg)显著抑制LPS诱导的B细胞增殖反应。5. DG给药可调节MRL/lpr小鼠T、B细胞亚群比例流式细胞术检测MRL/lpr小鼠脾脏T、B细胞亚群,结果显示,DG(2,4,8mg/kg)给药可明显降低MRL/lpr小鼠脾脏中CD3~+T细胞、活化T细胞(CD4~+CD69~+)、Th17细胞(CD4~+IL-17A~+)、TFH细胞(CD4~+CXCR5~+PD-1~+)亚群比例,DG(4,8mg/kg)能够显著降低浆细胞(CD19~-CD138~+)比例,DG(2,4,8mg/kg)可显著升高MRL/lpr小鼠脾脏的CD19~+B细胞比例,差异均有统计学意义。DG(2,4,8mg/kg)对幼稚T细胞(CD4~+CD62L~+)、表达CD40L Th细胞(CD4~+CD154~+)、边缘区B细胞(CD19~+CD21~+CD23~-)、滤泡区B细胞(CD19~+CD21~-CD23~+),成熟B细胞(CD19~+Ig D~+Ig M~-),未成熟B细胞(CD19~+Ig D~-Ig M~+)亚群无明显影响。6. DG给药可降低MRL/lpr小鼠血清s Ig D和anti-ds DNA抗体水平检测小鼠血清s Ig D和anti-ds DNA水平结果显示,MRL/lpr小鼠血清中s Ig D、anti-ds DNA水平明显高于正常组小鼠,DG(2,4,8mg/kg)给药可显著降低血清s Ig D和anti-ds DNA抗体水平,差异有统计学意义。7. DG给药对MRL/lpr小鼠血清中炎性细胞因子水平的影响免疫微球技术(CBA)检测血清中炎症因子的水平,结果显示,MRL/lpr小鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ水平显著上升,DG(2,4,8mg/kg)给药可显著降低MRL/lpr小鼠血清中TNF-α的水平,DG(2,4,8mg/kg)显著下调MRL/lpr小鼠血清中IFN-γ的水平;DG(2,4,8mg/kg)明显降低血清细胞因子IL-6水平,差异均有统计学意义。8. DG给药可下调MRL/lpr小鼠脾脏转录因子Bcl-6和细胞因子IL-21m RNA的表达q-PCR法检测脾脏组织中的转录因子Bcl-6的m RNA和细胞因子IL-21m RNA的表达,结果显示,MRL/lpr小鼠脾脏转录因子Bcl-6和炎性细胞因子IL-21m RNA表达水平均上调,DG(4,8mg/kg)给药组能可明显降低细胞因子IL-21m RNA水平和转录因子Bcl-6m RNA水平。9. DG给药可下调MRL/lpr小鼠肾脏组织p-JAK2、p-STAT3水平检测MRL/lpr小鼠肾脏组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,Western Blot实验结果显示,与模型小鼠相比,DG(2,4,8mg/kg)给药组明显下调p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,对JAK2,STAT3表达无显著影响。结论:1.DG皮下注射给药可改善脾脏和肾脏病理,减少肾脏免疫复合物沉积,对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎具有治疗作用,该作用可能与抑制JAK2/STAT3信号的磷酸化有关。2.DG给药可调节MRL/lpr小鼠脾脏T、B淋巴细胞的免疫紊乱,降低小鼠血清自身抗体水平以及IL-21、TNF-α、IFN-γ等炎症因子水平,这些作用可能与降低血清中s Ig D水平有关。