论文部分内容阅读
第一部分miR-320a和RACK1在结直肠癌中的表达与临床意义目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）在世界范围内发病率较高,是严重危害人类健康的重大疾病。我国CRC的发病率依然呈上升态势。早期发现、早期诊断、早期治疗可以获得较高的治愈率和较好的预后。故进一步探究CRC的发病机制,找寻新的无创肿瘤标志物与治疗靶点,对CRC的早期诊断、药物研发以及改善预后均具有重要的临床意义。miR-320a作为CRC相关miRNA的重要一员,已有文献报道其在CRC中扮演着抑癌因子的角色。本课题前期试验结合生物信息学软件预测结果提示,在CRC中miR-320a可能参与调控了活化蛋白激酶C1受体（receptor for activated C kinase1,RACK1）的表达。本部分旨在通过检测CRC患者癌组织内miR-320a和RACK1蛋白的表达以及血清和粪便中miR-320a的表达,评价miR-320a和RACK1蛋白对于CRC的诊断价值,分析CRC患者癌组织内miR-320a和RACK1蛋白的表达与临床病理特征间的关系。方法:1、采用qRT-PCR法检测CRC患者癌和癌旁组织内miR-320a的表达,同法检测CRC患者和健康体检者血清与粪便样本中miR-320a的表达。分别比较患者癌和癌旁组织中、患者与健康体检者血清样本中、患者与健康体检者粪便样本中miR-320a的表达差异。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分别评价组织、血清和粪便样本中miR-320a的检测对于CRC的诊断价值。2、采用蛋白质印迹法（western blot,WB）检测CRC患者癌和癌旁组织内RACK1蛋白的表达。比较癌和癌旁组织中RACK1蛋白的表达差异。ROC曲线评价组织样本中RACK1蛋白的检测对于CRC的诊断价值。3、收集CRC患者的临床病理资料,分析癌组织内miR-320a和RACK1蛋白的表达与患者临床病理特征间的关系。4、采用qRT-PCR法检测CRC患者癌和癌旁组织内RACK1 m RNA的表达。比较癌和癌旁组织内RACK1 m RNA的表达差异。Pearson检验分析RACK1 m RNA在癌和癌旁组织内表达变化与RACK1蛋白在癌和癌旁组织内表达变化的相关性;分析miR-320a在癌和癌旁组织内表达变化与RACK1蛋白在癌和癌旁组织内表达变化的相关性。5、使用生信软件Targetscan（Targetscan 6.0,http://www.targetscan.org）对miR-320a的目的基因进行预测。结果:1、miR-320a在CRC患者癌组织、血清和粪便样本中的表达均发生显著下调（P均<0.001）。ROC曲线分析显示:组织样本中miR-320a的曲线下面积（Area under the cure,AUC）值为0.705,对CRC诊断的敏感性为42.9%、特异性为71.4%;血清样本中miR-320a的AUC值为0.844,对CRC诊断的敏感性为76.2%、特异性为92.9%;粪便样本中miR-320a的AUC值为0.919,对CRC诊断的敏感性为81.0%、特异性为95.2%。2、RACK1蛋白在CRC患者癌组织中的表达发生显著上调（P<0.001）。ROC曲线分析显示组织样本中RACK1蛋白的AUC值为0.909,对CRC诊断的敏感性为90.5%、特异性为71.4%。3、CRC患者癌组织内miR-320a的表达与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移及脉管神经侵犯相关;肿瘤越大、分化程度越低、浸润程度越深、存在淋巴转移及脉管神经侵犯时,miR-320a的表达越低。RACK1蛋白的表达与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、有无脉管神经侵犯相关;肿瘤越大、分化程度越低、浸润程度越深、存在脉管神经侵犯时,RACK1蛋白的表达越高。4、RACK1 m RNA在CRC患者癌与癌旁组织内的表达无明显差异（P=0.054）。分析比较RACK1 m RNA在癌和癌旁组织内表达变化与RACK1蛋白在癌和癌旁组织内表达变化的相关性,结果显示二者的相关性很低（R=0.324,P=0.036）。分析比较miR-320a在癌和癌旁组织内表达变化与RACK1蛋白在癌和癌旁组织内表达变化的相关性,结果显示二者呈明显的负相关性（R=-0.800,P<0.001）。5、查询生信软件Targetscan发现miR-320a与RACK1基因的3’UTR存在互补序列,即RACK1为miR-320a的潜在目的基因。结论:1、结直肠组织中miR-320a和RACK1蛋白检测,对于CRC的诊断具有一定的敏感性和特异性。血清和粪便中miR-320a的检测在CRC的诊断中具有较好的敏感性与特异性,提示miR-320a可作为CRC诊断的潜在无创肿瘤标志物。2、在CRC患者的肿瘤组织中miR-320a与RACK1蛋白的表达变化存在较强的负相关性,低表达miR-320a及高表达RACK1蛋白均与CRC的进展相关,结合生信软件预测提示在CRC中miR-320a可能参与调控RACK1基因的表达。第二部分miR-320a靶向RACK1抑制结肠癌细胞增殖、迁移与侵袭的初步研究目的:RACK1在文献报道中大多作为癌基因促进各类肿瘤的产生与发展,其在CRC中所起的作用目前尚存在争议。miRNA调控着超过1/3的人类基因表达,是目前调控基因表达的第一大家族。文章第一部分的临床数据分析和生信软件预测结果提示CRC中miR-320a可能参与调控了RACK1基因的表达。本部分旨在明确RACK1蛋白在肠癌细胞恶性生物学行为中所起的作用。探讨结肠癌细胞中miR-320a对RACK1基因的靶向调控作用及其对于结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:1、检测miR-320a与RACK1蛋白在各结肠癌细胞系中的表达,筛选典型细胞系作为进一步实验对象。2、利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术,将靶向RACK1基因的短发卡RNA（short hairpin RNA,sh RNA）sh RACK1转染至HCT116细胞内。WB法测定转染sh RACK1后细胞内RACK1蛋白的表达,明确模型是否构建成功。采用MTT法观察转染sh RACK1后HCT116细胞增殖能力的改变。分别采用Transwell小室迁移和侵袭实验观察转染sh RACK1后HCT116细胞迁移与侵袭能力的改变。3、采用脂质体法将miR-320a模拟物agomiR-320a转染至HCT116细胞内。qRT-PCR法测定转染agomiR-320a后细胞内miR-320a的表达,检测转染效率。WB法测定转染agomiR-320a后细胞内RACK1蛋白的表达。采用MTT法观察转染agomiR-320a后HCT116细胞增殖能力的改变。分别采用Transwell小室迁移和侵袭实验观察转染agomiR-320a后HCT116细胞迁移与侵袭能力的改变。4、采用双荧光素酶报告基因法验证miR-320a对RACK1基因3’UTR的结合作用。结果:1、在各结肠癌细胞系中,HCT116细胞中miR-320a的表达最低,RACK1蛋白的表达最高,故选用HCT116细胞进行下一步试验。2、将sh RACK转染至HCT116细胞后,检测结果显示细胞内RACK1蛋白的表达显著下调,说明RACK1蛋白低表达细胞模型构建成功。MTT实验结果显示下调HCT116细胞内RACK1蛋白的表达会抑制肿瘤细胞的增殖能力。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示下调HCT116细胞内RACK1蛋白的表达会抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。3、将agomiR-320a转染至HCT116细胞后,检测结果显示细胞内miR-320a的表达显著上调,说明miR-320a过表达细胞模型构建成功;检测细胞内RACK1蛋白结果显示其表达显著下调,说明miR-320a可抑制RACK1基因的表达。MTT实验结果显示上调HCT116细胞内miR-320a的表达会抑制肿瘤细胞的增殖能力。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示上调HCT116细胞内miR-320a的表达会抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。4、双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-320a可与RACK1基因的3’UTR特异性结合并抑制荧光素酶的表达,证明RACK1为miR-320a的目的基因。结论:1、RACK1基因在结肠癌细胞中作为促癌因素存在,降低其表达将抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2、miR-320a在结肠癌细胞中通过靶向下调RACK1蛋白的表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭。